Hepatitis-B-Virus-Nukleinsäure-Assay-Kit (PCR-Fluoreszenzsonden-Methode) Für die Forschung

【Produktname】 Hepatitis-B-Virus-Nukleinsäure-Assay-Kit (PCR-Fluoreszenzsondenmethode)

【Paketspezifikation】48 Tests/Kit

Verwendungszweck

• The kit is intended for the quantitative determination of hepatitis B virus (HBV) Nukleinsäure (DNA) in serum or plasma samples.
• It is utilized for patients requiring testing for HBV infection and those undergoing antiviral therapy for hepatitis B.
• Designed to monitor the response to antiviral treatment and assess treatment effectiveness by tracking HBV DNA levels in patient blood.
• Jedoch, the test should not be solely relied upon as an indicator of a patient’s condition.
• It must be used alongside clinical manifestations and other laboratory tests to evaluate the patient’s overall condition.
• This kit is not suitable for HBV blood screening purposes.

Testprinzip

• The kit employs conformational magnetic beads to both lyse and purify viral nucleic acids in a standard PCR amplification tube.
• PCR amplification reagent is then directly added to the same tube, allowing the beads to directly participate in the fluorescent quantitative PCR reaction.
• TaqMan probe technology is utilized, wherein the 5’→3′ nucleic acid exonuclease activity of Taq DNA polymerase degrades the TaqMan probe during PCR.
• This degradation separates the fluorescent reporter group from the quenched group, generating a fluorescent signal.
• The real-time fluorescent PCR detection system collects this signal in real-time, enabling the quantitative determination of the viral content in the sample.
• Clinical serum samples containing inactivated hepatitis B virus serve as calibrators and quality controls for the kit.
• The kit monitors PCR inhibitors in the sample by detecting internal standards, mitigating the risk of false negatives.

Komponenten

Anmerkungen: A. Es gibt von Charge zu Charge Unterschiede in den Parametern der Kalibratoren ① Zu ④ und das Feste Werte für stark positive QCs und kritisch positive QCs (alle innerhalb des oben genannten Bereichs). Für Details, siehe die dem Kit beigefügte Gebrauchsanweisung.

1. Mischen Sie keine Komponenten aus verschiedenen Kit-Chargen!
2. Bringen Sie Ihre Testgegenstände mit: 0.2ml PCR-Reaktionsgefäße, Zentrifuge, verschiedene Größen von Pipetten und Spitzen, Und magnetischer Ständer, und verwenden Sie unseren empfohlenen Magnetständer.

Lagerbedingungen und Verfallsdatum

• Nukleinsäure-Extraktionskit, bei Raumtemperatur transportiert und bei 2-8°C gelagert.
• PCR-Amplifikationskit, höchstens transportiert werden 10 °C, gespeichert bei -20 °C ± 5 °C fern von Licht, vermeiden
• wiederholtes Einfrieren und Auftauen (nicht mehr als 3 mal).
• Verfallsdatum: Das Kit ist gültig für 12 Monate, Bitte verwenden Sie es innerhalb des Verfallsdatums. See label for details of production date and expiry date.

Anwendbar Instrumente

Zur Verwendung mit LightCycler® 480, SLAN-96P, Mx3005P, und ABI7500 Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Instrumente.

Musteranfrage

1. Geeigneter Probentyp: Serum oder Plasma
2. Beispielsammlung: Dieses Kit ist für Serum- oder Plasmaproben geeignet.

Serumprobe: 5 Dem Probanden werden mit einer sterilen Spritze ml venöses Blut entnommen und nicht länger als bei Raumtemperatur in ein steriles Zentrifugenröhrchen gegeben 6 Stunden lang stehen gelassen und von selbst ausfallen gelassen, oder direkt bei 1600g zentrifugiert 5 Minuten und der Überstand (Achten Sie darauf, keine roten Blutkörperchen abzusaugen) wird in ein steriles Zentrifugenröhrchen überführt.

Plasmaprobe: 2 ml bzw 5 Mit einer sterilen Spritze werden dem Probanden ml venöses Blut entnommen, In ein steriles Sammelröhrchen mit EDTA-Antikoagulans injiziert, gemischt, und nicht länger als bei Zimmertemperatur belassen 6 Stunden, damit die Probe von selbst ausfällt, oder direkt bei 1600g zentrifugiert 5 Minuten, um das Plasma abzutrennen und in ein steriles Zentrifugenröhrchen zu überführen.

3. Lagerung: Zu testende Proben können nach der oben genannten Behandlung sofort zum Testen verwendet werden, Andernfalls sollten sie gefroren unter -20 °C gelagert werden, um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.

4. Transport: Proben sollten in einer Schaumstoffbox mit Eis oder einem Eiskrug transportiert werden, im gefrorenen und versiegelten Zustand.

Testmethode

(ich) Reagenzvorbereitung (Bereich zur Vorbereitung der Reagenzien)

Preparation of HBV Lysate:

1. Thoroughly mix HBV lysate (DLB) containing magnetic beads.
2. Remove various reagent components and allow them to equilibrate to room temperature, vor Licht geschützt.
3. Mix HBV lysate and HBV internal standard in a ratio of 100 μl/Person + 1.0 μl/Person, and mix thoroughly.
4. Dispense the mixture immediately into PCR amplification tubes (0.2 ml Einzelröhrchen, 0.2 ml-Oktettröhrchen, oder 96-Well-PCR-Platten) bei 100 μl/Well, ensuring HBV lysate is at the bottom of the tube.

PCR Amplification Reagent Preparation:

• Konfigurationszeit: Reagent preparation is conducted after the nucleic acid extraction tubes have been placed in the magnetic rack.
• Vorbereitung: Based on the samples to be tested, prepare HBV negative quality control, HBV-kritische positive Qualitätskontrolle, Starke positive HBV-Qualitätskontrolle, und HBV-Kalibrator.
• For quantities of ① to ④, take corresponding amounts of HBV PCR reaction solution and HBV enzyme mixture, and mix according to (HBV PCR reaction solution 43.0 μl/Person + HBV-Enzymmischung (2.0 μl/Person)), mixing thoroughly to form PCR-Mix for immediate use.

(ii) Nukleinsäurereinigung (Probenverarbeitungsbereich)

1. Hinzufügen 100 μl der zu testenden Probe oder HBV-negative Qualitätskontrolle, HBV-kritische positive Qualitätskontrolle, Starke positive HBV-Qualitätskontrolle, HBV-Kalibrator ① bis ④ in das PCR-Röhrchen geben, in dem das HBV-Lysat dispensiert wurde; Vorsichtig durch Blasen mischen 3 Zu 5 mal; bei Zimmertemperatur stehen lassen 5 Zu 10 Protokoll.
2. Übertragen Sie die PCR-Röhrchen auf einen Magnetständer, verlassen für 2-3 Protokoll, and aspirate the supernatant using a pipette or negative pressure device, Achten Sie darauf, die Magnetperlen nicht zu entfernen.
3. Bewahren Sie die PCR-Röhrchen auf einem magnetischen Ständer auf, hinzufügen 250 μl HBV-Spüllösung (DWB) zu jedem Brunnen, verlassen für 2 Minuten und saugen Sie den Überstand mit einer Pipette oder einem Unterdruckgerät ab, Achten Sie darauf, keine Rückstände zu hinterlassen.

Zugabe des Amplifikationsreagenzes (Probenverarbeitungsbereich)

• Hinzufügen 45.0 μl PCR-Mix in jede Vertiefung geben.
• Cap the tube and invert it.
• Gently flick off the beads to ensure thorough mixing of the PCR-Mix with the beads.
• Instantaneously centrifuge the tube horizontally.
• Transfer the PCR tubes to the detection area.
• Place them on a fluorescent PCR instrument for detection.

PCR-Amplifikation (Erfassungsbereich)

Platzieren Sie das PCR-Reaktionsgefäß im Verstärker, Stellen Sie die HBV-Negativkontrolle ein, Starke HBV-Positivkontrolle, HBV-kritische Positivkontrolle, HBV-Kalibrator ① bis ④ und die zu untersuchende Probe in der entsprechenden Reihenfolge, und legen Sie den Probennamen und die Konzentration des Kalibrators fest.

Einstellungen des Verstärkungsprogramms.

SLAN-96P als Beispiel (LightCycler® 480, SLAN-96P und Mx3005P, ABI7500 haben das gleiche Setup. Einmal eingerichtet, Speichern Sie die Datei und führen Sie das Reaktionsprogramm aus

Zugriff auf Ergebnisse

1. Beschreibung der Verstärkungskurve: Die Verstärkungskurve ist im Allgemeinen S-förmig.
2. Grundeinstellung: Abhängig von der Versuchssituation, Als Grundlinien-Einstellbereich sollte ein Abschnitt mit einem stabilen Fluoreszenzhintergrundwert ausgewählt werden.
3. Schwellenwerteinstellung: den höchsten Punkt der Amplifikationskurve der negativen Qualitätskontrolle gerade überschreiten.
4. Ergebnisanalyse: Sobald die Basislinie und die Schwellenwerte festgelegt wurden, Die Ergebnisse können analysiert werden.

Wählen Sie den FAM-Kanal aus, um die Ergebnisse für die zu testende Probe und die Qualitätskontrolle zu erhalten; Wählen Sie den HEX- oder VIC-Kanal aus, um die Ergebnisse für den internen Standard zu erhalten. (Notiz: Detaillierte Einstellungen finden Sie in den Handbüchern der verschiedenen Instrumente.)

Referenzwerte

Die untere Nachweis- und Quantifizierungsgrenze für dieses Kit beträgt 5 IE/ml, bestimmt durch Forschungstests mit Referenzwerten von ≤40 für Ziel-Ct und ≤40 für internen Standard-Ct.

Beurteilung der Gültigkeit des Experiments

1. Die Kalibratoren waren alle positiv und hatten einen linearen Korrelationskoeffizienten|R|≥0,980.
2. Eine negative Qualitätskontrolle sollte nicht nachweisbar sein und einen internen Standard-Ct-Wert ≤ haben 40.
3. Stark positive Kontrollen haben einen Ct-Wert <25 und ein Quantifizierungsbereich von (1.0-5.0) X 105 IE/ml Kritisch positive Kontrollen haben einen Ct-Wert <38 und ein Quantifizierungsbereich von (10- 100) IE/ml. Die oben genannten Anforderungen müssen im selben Experiment erfüllt sein, ansonsten, Die Testergebnisse gelten als ungültig und müssen erneut getestet werden.

Interpretation der Testergebnisse

1. Wenn das Probenergebnis ist 5-2.0 X 109 IU/ml und die Amplifikationskurve zeigt eine S-Form, während der Ct-Wert der Probe ≤40 und der Ct-Wert des internen Standards ≤40 beträgt, Das Ergebnis wird als gültig beurteilt und die positiven und entsprechenden Konzentrationswerte können direkt gemeldet werden.
2. Wenn das Probenergebnis ist >2.0 X 109 IU/ml und die Amplifikationskurve zeigt eine S-Form, the sample Der Ct-Wert beträgt ≤40, und der interne Standard-Ct-Wert beträgt ≤40, kann direkt als HBV-DNA gemeldet werden >2.0 X 109 IE/ml. Wenn eine genaue Quantifizierung erforderlich ist, Die Probe kann auf folgende Werte verdünnt werden 2.0 X 109 IU/ml und erneut getestet
3. Wenn das Probenergebnis HBV-DNA ist <5IE/ml, Der Ct-Wert der Probe beträgt ≤40 und der Ct-Wert des internen Standards beträgt ≤40, Das Ergebnis wird als HBV-DNA-Konzentration unterhalb der unteren Nachweisgrenze des Kits angegeben; wenn der interne Standard abnormal ist (Ct >40 oder kein Wert), Das Ergebnis der Probe ist ungültig und die Ursache sollte gefunden und ausgeschlossen werden und die Probe sollte wiederholt werden (wenn das Ergebnis der Wiederholungsprüfung immer noch ungültig ist, bitte kontaktieren Sie uns). (wenn das Ergebnis der Wiederholungsprüfung weiterhin ungültig ist, bitte kontaktieren Sie uns).