Mitochondrial Genome DNA Extraction Kit (for Animals)

1. Bestandteile des Reagenzienkits

2. Lagerung

This kit can be stored at room temperature (15-25℃) in dry conditions for 12 Monate. The DNA extraction purification columns can be stored in a cool and dry environment for 1 Jahr. Proteinase K und RNase A enthalten Konservierungsstoffe, ermöglicht den Transport bei Raumtemperatur, aber zur Langzeitlagerung, Sie sollten bei -20℃ aufbewahrt werden. Reagent buffers E1/E2 should be stored at 4℃.

3. Anweisungen zur Verwendung des Reagenzienkits

3.1 Dieses Reagenzienkit ist für die molekularbiologische Forschung bestimmt und sollte nicht zur Diagnose oder Behandlung von Krankheiten verwendet werden.

3.2 Einige Komponenten im Reagenzienkit enthalten Reizstoffe. Schutzmaßnahmen wie das Tragen von Schutzkleidung und Schutzbrille werden empfohlen.

3.3 Während der Verwendung dieses Reagenzienkits, eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge, Wasserbad (Metallbad), Vortexmixer, Wasserfreies Ethanol, PBS,steriles entionisiertes Wasser, und EP-Röhren müssen vom Benutzer vorbereitet werden.

4. Einführung in das Reagenzienkit

The Mitochondrial Genome DNA-Reinigung Kit offers a rapid and efficient method for purifying DNA from animal tissues and cell cultures. Widely used in both animal tissue and cell cultures, this kit consists of two parts. The first part involves rapid collection of high-purity animal tissue and cell mitochondria using gradient centrifugation. The second part utilizes a column-based method for quick extraction of mitochondrial DNA without the need for toxic reagents like phenol-chloroform. Die extrahierte DNA kann direkt verwendet werden PCR, Southern Blot, und andere Anwendungen.

5. Experimentelle Prinzipien und Verfahren

6. Extraktionsprozess

Vor Beginn des Experiments:

A. Reagent Buffers B and C tend to precipitate under low-temperature conditions. It is recommended to heat them at 65°C for 5 minutes until the precipitates dissolve before normal use.

B. Before using Waschpuffer 1, follow the instructions on the reagent bottle label to add the specified amount of absolute ethanol. Dann, check the label to indicate that ethanol has been added.

C. Elutionspuffer ist ein 0.1x TE-Lösung with minimal EDTA content. Wenn EDTA nachfolgende Experimente beeinflusst, it is suggested to use sterile deionized water instead of the elution buffer.

D. Mitochondrial Collection: The first part involves collecting mitochondria, where centrifugation is crucial. During the extraction process, centrifugal force is expressed in ‘g’. Most centrifuges have a rpm/g conversion mode, so please pay attention.

1. Probenverarbeitung:

A. Take cell culture medium, centrifuge at 1000g for 1 minute to collect cells. Try to remove as much supernatant as possible. Hinzufügen 1ml PBS (PH7.9) to wash the cells, centrifuge to collect them, dann hinzufügen 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 to fully suspend the cells and homogenize rapidly 5-10 mal.

B. Cut tissues not exceeding 200 mg into small pieces, hinzufügen 1ml PBS (PH7.9) for washing and absorb excess liquid with filter paper. Hinzufügen 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 and grind in an ice bath about 20 mal.

2. Transfer the liquid mixture to a centrifuge tube, Zentrifuge bei 4℃, 1000g for 5 Protokoll, and transfer the supernatant to a new centrifuge tube.

(Notiz: There may be precipitates in this transferred supernatant. For obtaining high-purity mitochondria, it is recommended to centrifuge and transfer the supernatant during step 2.)

3. Transfer the supernatant obtained in the previous step to a new centrifuge tube, centrifuge at 12000g, 4℃ für 10 Protokoll, and discard the supernatant.

(Notiz: After this step, mitochondria will precipitate at the bottom of the tube.)

4. Recommended step: Hinzufügen 5ml Reagent Buffer E2 to the mitochondrial pellet, resuspend it, Zentrifuge bei 4℃, 1000g for 5 Protokoll, transfer the supernatant to a new centrifuge tube, then centrifuge at 12000g, 4℃ für 10 Protokoll, Den Überstand verwerfen, and obtain high-purity mitochondrial precipitates at the tube bottom.

(Notiz: Mitochondria collection at this step is complete. You may interrupt the experiment and store mitochondria at -70℃.)

Second Part: Isolation and Purification of Mitochondrial DNA

5. Hinzufügen 280μl of Reagent Buffer B, 10μl RNase A, and 10μl of Proteinase K to the centrifuge tube containing mitochondria. Thoroughly invert to mix, digest at 65℃ für 5 Protokoll.
6. Hinzufügen 300μl of Reagent Buffer C to the lysate and mix well. If a white precipitate appears, it can be left undisturbed; its disappearance will not affect subsequent experiments.
7. Hinzufügen 300μl of absolute ethanol and mix thoroughly. It may cause precipitation, but it won’t affect subsequent experiments.
8. Transfer the obtained liquid to the DNA extraction purification column (Satz) (approximately 650~700μl each time). Centrifuge at more than 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie den gesammelten Abfall, und setzen Sie das Sammelröhrchen für den nächsten Schritt wieder in die Reinigungssäule ein.
9. Platzieren Sie die DNA-Extraktions-Reinigungssäule (Satz) into a collection tube, hinzufügen 300μl Waschpuffer 1, centrifuge at more than 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie den Abfall, and re-insert the DNA extraction purification column (Satz) in die Röhre für den nächsten Schritt.

(Notiz: Confirm that absolute ethanol has been added to Wash Buffer 1.)

10. Hinzufügen 400μl Waschpuffer 1 zur DNA-Extraktions-Reinigungssäule (Satz), Zentrifuge bei 14,000 U/min (20,000×g) für 2 Protokoll. Extend centrifugation time appropriately for a drier membrane.
11. Platzieren Sie die DNA-Extraktions-Reinigungssäule (Satz) in a new centrifuge tube, open the cap, and incubate at 65℃ für 2 Protokoll. Extend this step as needed to evaporate ethanol completely to prevent residual ethanol from affecting downstream experiments.
12. Drip-suspend 50-100μl Elutionspuffer auf die Membran, Zentrifuge bei 12,000 U/min für 2 Protokoll.

(Notiz: 1. Eluting DNA with 50μl of Elution Buffer can increase DNA concentration but reduce the total yield; 2. The eluted DNA wash can be reapplied to the DNA extraction purification column for an additional collection at 12,000 U/min für 2 minutes to increase DNA yield.)