Super-Pure RNA Extraction Kit (TRIzol)

1. Bestandteile des Reagenzienkits

2. Lagerung

Dieses Reagenzienkit sollte bei Raumtemperatur gelagert werden (15-25℃) in a dry environment and is stable for 12 Monate. DNase I contains a preservative, ermöglicht den Transport bei Raumtemperatur, aber zur Langzeitlagerung, es sollte bei -20℃ gehalten werden.

3. Anweisungen zur Verwendung des Reagenzienkits

3.1 Dieses Kit ist für molekularbiologische Forschungszwecke bestimmt und sollte nicht zur Diagnose oder Behandlung von Krankheiten verwendet werden.

3.2 Einige Bestandteile des Kits enthalten Reizstoffe; Es ist ratsam, die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen zu treffen (wie das Tragen von Schutzkleidung und Schutzbrillen).

3.3 Die Verwendung dieses Kits erfordert zusätzliche Ausrüstung wie eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge, Wasserbad (Metallbad), Vortexmixer, Wasserfreies Ethanol, flüssiger Stickstoff, Chloroform, steriles entionisiertes Wasser, und EP-Röhren.

4. Einführung in das Reagenzienkit

This RNA purification kit utilizes the traditional TRIzol combined with column membrane method for the rapid purification of plant, animal, tissue, cell, microbial RNA, and fungal hyphae RNA. It is suitable for most species. This RNA purification kit can be applied to plant tissues exceeding 100 mg. The RNA extracted with this kit has extremely low DNA content. If sensitivity to DNA in experiments is a concern, it is recommended to use DNase I digestion on the column.

The RNA Fast Purification Kit can extract total RNA from samples (including nuclear RNA and cytoplasmic RNA) within 1 Stunde. The extracted RNA can be directly used for RT-PCR, Northern blotting, und andere Anwendungen.

5. Experimentelle Prinzipien und Verfahren

6. Extraktionsprozess

Vorsichtsmaßnahmen vor Beginn des Experiments:

A. Vor Gebrauch, add the specified amount of absolute ethanol to WaschenPuffer 1 according to the label on the reagent bottle, and check the box on the label to indicate that absolute ethanol has been added.

B. Elutionspuffer ist ein 0.1x TE-Lösung mit minimalem EDTA-Gehalt. Wenn EDTA nachfolgende Experimente beeinflusst, it is recommended to replace the Elution Buffer with sterile deionized water.

1. Probenverarbeitung:

A. Gewebe: If fresh materials cannot be used immediately, place them in liquid nitrogen and store them at -80°C. Getrocknete Materialien können bei Raumtemperatur gelagert werden. Grind 30~80 mg of tissue in liquid nitrogen and add 1 ml Trizol buffer for homogenization.

B. Monolayer Cultured Cells: Aspirate the culture medium and add 1 ml Trizol buffer for homogenization.

C. Cell Suspension: Centrifuge to collect cells and add 1 ml Trizol buffer for homogenization.

2. After adding Trizol buffer to the sample, mix thoroughly by pipetting, allow complete sample lysis, and incubate at room temperature for 5 Protokoll.

3. Add chloroform in a ratio of 200 μl per 1 ml of Trizol buffer, vigorously shake for 30 Sekunden, and incubate at room temperature for 2 Protokoll.

4. Centrifuge the lysate at 4°C, 12,000 U/min für 10 Protokoll. RNA will be present in the upper aqueous phase.

5. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Zentrifugenröhrchen, avoiding the collection of the middle and bottom layers. (Notiz: Etwa 400 Es können μl Flüssigkeit übertragen werden, which may be less for some species.)

6. Add an equal volume of pre-chilled absolute ethanol, mix quickly. (Zum Beispiel, hinzufügen 400 μl Lysat, hinzufügen 400 μl of absolute ethanol. Wenn das Lysatvolumen kleiner ist als 400 μl, reduce the amount of absolute ethanol proportionally. A slight precipitate may form after adding ethanol, but it does not affect subsequent experiments.)

7. Transfer the obtained liquid to an RNA purification column (etwa 650-700 μl per time), centrifuge at more than 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie den gesammelten Abfall, und setzen Sie das Sammelröhrchen für den nächsten Schritt wieder in die Reinigungssäule ein.

8. Schritt wiederholen 7, adding the remaining liquid to the RNA purification column, centrifuge at more than 8,000 U/min für 1 Minute, discard the waste and the collection tube.

9. Place the RNA purification column in a new collection tube, hinzufügen 300 μl of Inhibitor Removal Buffer, centrifuge at more than 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie den Abfall, and reinsert the RNA purification column into the tube for the next step.

10. Hinzufügen 80 μl of DNase Iworking solution to the RNA purification column, incubate at 20°C to 30°C for 15 Protokoll. (Prepare DNase I working solution: 62 μl RNase-Free Water, 8 μl 10× Reaction Buffer, Und 10 μl DNase I, make up to 80 μl DNase I working solution.)

11. Hinzufügen 300 μl of Inhibitor Removal Bufferto the RNA purification column, centrifuge at more than 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie den Abfall, and reinsert the RNA purification column into the tube for the next step.

12. Hinzufügen 700 μl Waschpuffer 1to the RNA purification column, Zentrifuge bei 14,000 U/min (20,000×g) für 2 Protokoll, extend the centrifugation time if needed for a drier membrane. (Notiz: Confirm the addition of ethanol to Wash Buffer 1; ethanol presence significantly affects subsequent experiments. Ensure the membrane is dry after centrifugation before elution. Entsorgen Sie den Abfall und das Sammelröhrchen. After using Wash Buffer 1, the membrane on the RNA purification column should only have a slight color. Carefully remove the RNA purification column after centrifugation, ensuring it does not touch the collection tube to avoid ethanol contamination.)

13. Place the RNA purification column in a new centrifuge tube, drip 100 μl Elutionspufferauf die Membran, incubate at room temperature for 5 Protokoll (15°C to 25°C), and centrifuge at more than 8,000 U/min für 1 Minute. (Notiz: Eluting RNA with 50 μl of Elution Buffer can increase RNA concentration but decrease total RNA yield.)

14. Repeat the previous step. (Notiz: A new centrifuge tube can be used to collect the RNA eluted the second time or continue using the original collection tube to collect RNA.)