Kit de extracción de ADN genómico de plantas a pequeña escala con método CTAB

1. Componentes del kit de reactivos

2. Almacenamiento

Este kit debe almacenarse a temperatura ambiente. (15-25℃) en condiciones secas y se puede almacenar durante 12 meses. Las columnas de purificación y extracción de ADN se pueden almacenar en un ambiente fresco y seco durante hasta 1 año. La ARNasa A contiene un conservante y puede transportarse a temperatura ambiente., pero para almacenamiento a largo plazo, debe mantenerse a -20 ℃.

3. Instrucciones para usar el kit de reactivos

3.1 Este kit está destinado a fines de investigación de biología molecular y no debe utilizarse para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades..

3.2 Algunos componentes del kit contienen irritantes.; es recomendable tomar las precauciones necesarias (como usar ropa y gafas protectoras).

3.3 El uso de este kit requiere equipo adicional como una centrífuga de alta velocidad., baño de agua (baño de metal), mezclador Vortex, etanol anhidro, nitrógeno líquido, cloroformo, agua desionizada estéril, y tubos EP.

4. Introducción al kit de reactivos

El CTAB-planta basada Purificación de ADN El kit proporciona un método CTAB mejorado para purificar el ADN, Utilizando un tampón de unión específico que precipita eficientemente el ADN., y posteriormente recoge ADN de alta pureza a través de una columna de adsorción.

Este kit es ampliamente utilizado para tejidos vegetales y hongos., capaz de extraer ADN total de muestras dentro 2 horas (Incluyendo el ADN mitocondrial y el ADN del cloroplasto.). El ADN extraído se puede utilizar directamente para experimentos posteriores, como PCR, transferencia del sur, y otros.

5. Principios y procedimientos experimentales

6. Proceso de extracción

Precauciones antes de comenzar el experimento.:

1. Tampones reactivos A y C puede precipitar en condiciones de baja temperatura. Se recomienda calentar a 65°C durante 5 minutos y utilizar después de que los precipitados se hayan disuelto.
2. LavarBuffer 1 Se debe agregar la cantidad especificada de etanol anhidro como se indica en la etiqueta de la botella.. Marque la etiqueta una vez que se haya agregado etanol..
3. El tampón de elución es un 0.1x solución TEque contiene un mínimo de EDTA. Si el EDTA afecta a experimentos posteriores, Se recomienda agua desionizada estéril como sustituto del tampón de elución..

1. Manejo de muestras:
2. Recolección y almacenamiento de materiales:

Material recién recogido, si no se usa inmediatamente, debe colocarse en nitrógeno líquido y finalmente almacenarse a -80°C. Los materiales secos se pueden almacenar a temperatura ambiente..

1. Si es posible, recolecte material fresco ya que contiene menos polisacáridos y polifenoles.
2. Al recolectar hongos de cultivo líquido., separar el líquido por centrifugación y recoger los cuerpos fúngicos.
3. Moler alrededor 100 mg de muestras frescas o no más de 20 mg de material seco utilizando nitrógeno líquido.

(Nota: Diferentes cantidades de muestra pueden requerir optimización mediante experimentos preliminares antes de su uso..)

3. Agregar 550 µl de tampón reactivo A y 10 µl de RNasa A (10 mg/ml) para garantizar que no haya grumos de tejido en la muestra molida. Los grupos de tejido son difíciles de lisar y pueden reducir la producción de ADN.. No mezclar tampón reactivo A y RNasa Aantes de usar.
4. Incubar a 65°C durante 20-30 minutos, invertir suavemente 2-3 veces. Este paso es para la lisis celular..
5. Centrifugar el lisado para 5 minutos a las 14,000 rpm (20,000×g).

(Nota: Algunos materiales vegetales pueden tener muchas sustancias pegajosas en este paso., que puede cortar el ADN en pasos posteriores. Idealmente, eliminar estas sustancias transfiriendo el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga después de la centrifugación.)

6. Transfiera con cuidado el líquido obtenido en el paso anterior a un nuevo tubo de centrífuga..

(Nota: Aproximadamente 500 Se pueden transferir µl de líquido.; para algunas especies, puede ser menos que 500 µl.)

7. Agregue un volumen igual de cloroformo al lisado e invierta suavemente para mezclar..

(Nota: Por ejemplo, agregar 500 µl de cloroformo si tienes 500 μl de lisado. Si el volumen del lisado es menor que 500 µl, ajustar el volumen de cloroformo en consecuencia.)

8. Centrifugar en 12,000 rpm para 10 minutos.
9. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. (aproximadamente 500 µl).
10. Agregue un volumen igual de tampón reactivo C y un volumen igual de etanol anhidro al lisado, y mezclar.

(Por ejemplo, si agregas 450 µl de tampón reactivo C, Luego añade 450 µl de etanol anhidro. Si el volumen del lisado es menor que 450 µl, reducir proporcionalmente la cantidad de tampón reactivo C. Se producirá algo de precipitación al agregar el tampón reactivo C., pero no afectará los experimentos posteriores..)

11. Transferir el líquido obtenido a una columna de purificación de ADN. (equipo), aproximadamente 650-700 µl cada vez. Centrifugar a más 8,000 rpm para 1 minuto, desechar los residuos recogidos, y vuelva a insertar el tubo de recolección en la columna de purificación para el siguiente paso.
12. Repita el paso 11, agregar el líquido restante a la columna de purificación de ADN (equipo) y centrifugar a más 8,000 rpm para 1 minuto. Desechar los residuos y el tubo de recogida..
13. Coloque la columna de purificación de ADN. (equipo) en un nuevo tubo de recolección, agregar 300 µl de Lavar Buffer 1, centrifugar a más 8,000 rpm para 1 minuto, desechar los residuos, y reinsertar la columna de purificación de ADN (equipo) en el tubo para el siguiente paso.

(Nota: Asegúrese de que se haya añadido etanol anhidro a Lavar Buffer 1.)

14. Agregar 500 µl de tampón de enjuague 1 a la columna de purificación de ADN (equipo), centrifugar en 14,000 rpm (20,000×g) para 2 minutos, prolongar ligeramente el tiempo de centrifugación para una membrana más seca.
15. Coloque la columna de purificación de ADN. (equipo) en un nuevo tubo de centrífuga, abierto, y calentar a 65°C durante 2 minutos. Este paso puede prolongarse para evaporar el etanol tanto como sea posible para evitar que el etanol residual afecte los experimentos posteriores..
16. Goteo 100 µl de tampón de eluciónsobre la membrana, centrifugar en 12,000 rpm para 2 minutos.

(Nota: 1. Eluir ADN con 50 µl de tampón de elución puede aumentar la concentración de ADN pero disminuir el rendimiento total de ADN. 2. El eluato se puede volver a aplicar a la columna de purificación de ADN para una segunda elución., centrifugar en 12,000 rpm para 2 minutos para recoger, que puede mejorar el rendimiento del ADN.)