Kit de prueba de ácido nucleico del poliomavirus aviar 丨 Método de molécula

Este producto debe empacarse con bolsas de hielo y enviarse a través de FedEx o UPS..

Introducción del producto：

Este kit de reactivos puede realizar la detección por amplificación de los genes conservados del virus del polioma aviar. (APV) en muestras como pájaro plumas, sangre, tejidos, hisopos orales/genitales, etc.. Introduciendo una referencia interna endógena, El proceso de extracción y amplificación del ácido nucleico se puede monitorear para garantizar la precisión de los resultados de la prueba..

Contenido del producto：

Condiciones de almacenaje：

Almacenar a -20 ℃, la vida útil es al menos 12 meses

Operación experimental：

1. preparación de la muestra (Área de preparación de muestras)

1.1 Requisitos de muestra：

• Plumas: Recoger un mínimo de 5 plumas del pecho, abdomen, o piernas (incluyendo la parte del eje de la pluma), y no utilice plumas que se desprenden naturalmente.
• Sangre: Utilice EDTA como anticoagulante., no use heparina como anticoagulante. Se debe utilizar sangre entera fresca., o se puede almacenar a 2 ~ 8 ℃ por hasta 7 días, o almacenado a -20 ℃ por hasta 3 meses. Evite congelar y descongelar repetidamente tanto como sea posible..
• Tejido: Tome tejido fresco de músculo u órgano. (Evite el uso de muestras con piel., tendones, o fascia que son difíciles de procesar) de no más de 100 mg. Prepare el homogeneizado de tejido utilizando 200-500 μl de agua esterilizada., y luego proceder con la preparación posterior de la muestra.

1.2 preparación de la muestra：

• Consulte el manual de Three Lions Biotech. “Kit de extracción rápida de ADN genómico animal (para PCR análisis)” (Número de pieza: DP202), u otros kits/métodos de extracción de ácidos nucleicos que cumplan los requisitos pertinentes, para la extracción de muestras procesadas.
• Coloque la muestra de ácido nucleico extraída en una hielera e intente continuar con la prueba lo antes posible..
• Se puede almacenar a 4°C hasta por 7 días o a -20°C hasta 6 meses.

2 . Preparación del sistema de reacción. (Área de reacción para agregar muestras.).

2.1 Saque n+2 tubos de reacción que contienen control positivo APV, control negativo APV, y la solución de reacción necesaria para el experimento. (n representa el número de muestras a analizar, más 1 control positivo, y 1 control negativo). Descongelar completamente los reactivos a temperatura ambiente., centrífuga para 10 segundos, y haga girar el líquido dentro de las paredes y tapas del tubo hasta el fondo del tubo.. Colóquelos en una hielera para su uso posterior..

2.2 Entonces, añadir 2μL de control negativo, ácido nucleico de muestra extraída, y control positivo APV a la solución de reacción en secuencia. Cerrar las tapas de los tubos, hacer registros adecuados, y asegúrese de que el volumen total de cada reacción sea de 25 μL. Mezclar bien el contenido., centrífuga para 10 segundos, y luego proceder con el experimento de amplificación en el instrumento de PCR.

3. amplificación por PCR (Área de amplificación y análisis de productos).

• El proceso de amplificación por PCR es el siguiente.:
  • Predesnaturalización a 95 ℃ para 3 minutos.
  • Desnaturalización a 95 ℃ para 10 segundos.
  • Recocido y extensión a 60 ℃ para 40 segundos, por un total de 35 ciclos.
  • Recoge señales de fluorescencia a 60 ℃.
• En la detección de fluorescencia, seleccione FAM para el primer canal (para el gen específico de APV), y seleccione VIC/HEX para el segundo canal (para gen de referencia endógeno).
• Si se utiliza un instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real de la serie ABI, Puede comunicarse con el fabricante con anticipación o agregar el tinte de calibración ROX usted mismo si es necesario.; de lo contrario, seguir el procedimiento normal.

4. Determinación del resultado

4.1

• Si los valores Ct del control positivo tanto en el canal FAM como en el canal VIC/HEX son <30 y mostrar un “S”-curva de amplificación en forma, y el control negativo no tiene valor Ct o un valor Ct ≥35 y no “S”-curva de amplificación en forma, el resultado experimental es válido.
• De lo contrario, el experimento debe repetirse, y si la repetición del experimento aún no es válida, por favor contacte al personal técnico.

4.2

• El valor Ct de la muestra en el canal VIC/HEX debe ser ≤32 y mostrar un “S”-curva de amplificación en forma, indicando que la extracción y amplificación de la muestra son efectivas.
• Si no hay ningún valor de Ct o el valor de Ct es 32 < CT ≤ 35 en el canal VIC/HEX, Indica que la extracción de ácido nucleico de la muestra no cumple con el estándar o que existe una fuerte interferencia de inhibición. (como residuos de alcohol o desinfectantes, anticoagulantes, etc.) que inhibe la amplificación.
• Se recomienda reprocesar la muestra para la extracción y amplificación de ácidos nucleicos..

4.3 Después de que la detección en el canal VIC/HEX sea válida, la determinación en el canal FAM se realiza de la siguiente manera:

• Valor CT ≤ 32 y un “S”-Se observa una curva de amplificación formada., se determina como positivo para APV, indicando la presencia del virus APV en la muestra.
• El valor Ct es 32 < Connecticut < 35, se considera sospechoso, y la muestra debe volverse a analizar (reextrayendo y probando el ácido nucleico, se sugiere excluir primero “falso positivo” resultados causados ​​por la contaminación ambiental por aerosoles). Si la nueva prueba en el canal FAM después de excluir la contaminación por aerosol muestra un valor Ct < 35 y una curva de amplificación clara, se determina como positivo para APV; de lo contrario, se determina como negativo.
• Sin valor Ct o valor Ct ≥ 35 y no “S”-curva de amplificación en forma, se determina como negativo para APV, indicando que el virus APV no fue detectado en la muestra.

Precauciones：

1. Para prevenir la contaminación, El experimento debe realizarse estrictamente con operaciones particionadas.. Es preferible contar con aislamiento físico entre tabiques para evitar la contaminación cruzada causada por factores humanos.. Use batas de laboratorio y guantes de látex durante el experimento., y utilizar herramientas separadas en diferentes áreas. Cambie los guantes y batas de laboratorio según sea necesario.. Después de la PCR, no abra las tapas inmediatamente. Espere a que se enfríe lo suficiente antes de abrirlo para tomar muestras para minimizar la contaminación por aerosoles..
2. Descongelar completamente los reactivos antes de su uso., pero evite congelar y descongelar repetidamente. Siga estrictamente las instrucciones para la preparación de reactivos., adición de muestra, y otros pasos. el banco de trabajo, centrífugo, pipetas, y otros instrumentos deben desinfectarse periódicamente con desinfectantes que contengan cloro, etanol, agentes de eliminación de contaminación de ácidos nucleicos, o lámparas ultravioleta.
3. Un resultado negativo no significa necesariamente que sea un hombre.. Mutaciones desconocidas, mala calidad de la muestra, baja concentración, o la presencia de fuertes sustancias inhibidoras en la extracción de ácidos nucleicos. (pruebas) también puede conducir a “negativo” resultados. Este kit sólo se utiliza para la amplificación específica del gen CHD-W en loros.. Para otros productos, por favor consulte al fabricante.
4. Este producto es para un solo uso.. No congelar y descongelar repetidamente. Es sólo para fines de investigación científica y no debe utilizarse para diagnóstico clínico u otros fines..