Descripción del producto
NR (CE 1.7.1.3) Es una enzima ampliamente encontrada en las plantas.. Desempeña un papel crucial en la conversión de nitrógeno nitrato en nitrógeno amoniacal y también es una enzima inducible., afectando el rendimiento y la calidad de los cultivos. NR cataliza la reducción de nitrato a nitrito: NUMERO 3- + NADH+H+ → NO2- + NAD+ + H2O. En condiciones ácidas, el NO2 producido- puede participar en una reacción de diazotización para formar un compuesto de color magenta. Este compuesto tiene un pico de absorción en 540 Nuevo Méjico, y el cambio en la absorbancia en 540 nm se puede utilizar para representar la actividad enzimática.
Componentes del kit
- Solución madre de inductor: 50 mlx 1 botella
- Solución de extracción: 30 mlx 1 botella
- reactivo uno: 12 mlx 1 botella
- Reactivo dos: Polvo x 2 viales
- Reactivo tres: 15 mlx 1 botella
- Reactivo cuatro: 15 mlx 1 botella
- Estándar: 1 mlx 1 frasco
Preparación de la solución
- Solución inductora: Diluya la solución madre del inductor 10 veces con agua destilada antes de su uso.. Llevar 10 mL de solución madre de inductor y agregar 90 ml de agua destilada. Mezclar bien. Prepárelo fresco antes de cada uso..
- Reactivo dos: Agregar 1 ml de agua destilada. Aliquot y almacenar a -20°C. Se puede almacenar por 2 semanas a -20°C. Antes de usar, diluir el Reactivo Dos 50 veces con agua destilada. Llevar 10 μL de Reactivo Dos y agregar 490 µL de agua destilada. Mezclar bien.
- Estándar: Prepara un 0.1 solución estándar de nitrito de sodio μmol/mL diluyendo la 10 Solución estándar de nitrito de sodio μmol/ml 100 veces con agua destilada antes de su uso.
Notas
- Si la absorbancia es mayor que 0.8, diluir la muestra con solución de extracción. Preste atención a ajustar el factor de dilución en consecuencia en la fórmula de cálculo..
- Siga estrictamente el orden de adición de reactivos que figuran en la tabla de ensayo de muestras para el experimento..
Procedimientos experimentales
I. Tratamiento de muestra
Pretratamiento del tejido:
- Agregue una cantidad adecuada de solución inductora a un vaso de precipitados.. Lavar muestras frescas, secarlos con papel de filtro, y colocarlos en la solución inductora. (suficiente para sumergirse). Incubar en la oscuridad durante 2 horas. Eliminar muestras, secarlos con papel de filtro, y congelar a -20°C durante 30 minutos. Descongelar las muestras y secarlas nuevamente con papel de filtro.. (Realizar tratamiento de inducción según sea necesario.. Generalmente, No se requiere tratamiento de inducción.. Si los resultados previos al experimento no muestran actividad, Es necesario el tratamiento de inducción.)
- Pesar aproximadamente 0.1 g de muestra y añadir 1 mL de solución de extracción según la proporción del peso del tejido. (gramo) al volumen de la solución de extracción (mililitros) de 1:5 a 10. Moler en un baño de hielo, centrifugar en 8000 gramo, 4°C para 10 minutos, y recoger el sobrenadante. Mantenga el sobrenadante en hielo para realizar pruebas..
Pretratamiento de células o bacterias:
- Recoja muestras de células o bacterias en un tubo de centrífuga y deseche el sobrenadante.. Agregar 1 mL de solución de extracción por 5 Millones de células o bacterias.. Sonicar las bacterias o células. (fuerza 200 W., sonicación 3 segundos, intervalo 10 segundos, repetir 30 veces). Centrifugar en 8000 gramo, 4°C para 10 minutos, recoger el sobrenadante y mantenerlo en hielo para realizar pruebas.
II. Pasos del ensayo
- Precalentar el espectrofotómetro visible durante al menos 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 540 Nuevo Méjico, y cero con agua destilada.
- Ensayo de muestra:
| Nombre del reactivo | Tubo de ensayo | Tubo de control | Tubo estándar | tubo en blanco |
|---|---|---|---|---|
| Muestra | 100 µL | – | – | – |
| 0.1 Solución estándar µmol/mL | – | – | 100 µL | – |
| Agua destilada | – | 375 µL | – | 475 µL |
| reactivo uno | 375 µL | – | 375 µL | – |
| Reactivo dos | 125 µL | 125 µL | 125 µL | 125 µL |
| Reactivo tres | 250 µL | 250 µL | 250 |
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