Kit d’extraction d’ADN génomique végétal à petite échelle de la méthode CTAB

1. Composants du kit de réactifs

2. Stockage

Ce kit doit être conservé à température ambiante (15-25℃) dans des conditions sèches et peut être stocké pendant 12 mois. Les colonnes de purification par extraction d'ADN peuvent être stockées dans un environnement frais et sec jusqu'à 1 année. La RNase A contient un conservateur et peut être transportée à température ambiante, mais pour un stockage à long terme, il doit être maintenu à -20 ℃.

3. Instructions d'utilisation du kit de réactifs

3.1 Ce kit est destiné à des fins de recherche en biologie moléculaire et ne doit pas être utilisé pour le diagnostic ou le traitement de maladies..

3.2 Certains composants du kit contiennent des irritants; il est conseillé de prendre les précautions nécessaires (comme porter des vêtements de protection et des lunettes).

3.3 L'utilisation de ce kit nécessite un équipement supplémentaire tel qu'une centrifugeuse à grande vitesse, bain d'eau (bain en métal), mélangeur de vortex, éthanol anhydre, l'azote liquide, chloroforme, eau déminéralisée stérile, et tubes EP.

4. Introduction au kit de réactifs

Le CTAB-basé sur l'usine Purification de l'ADN Le kit fournit une méthode CTAB améliorée pour purifier l’ADN, en utilisant un tampon de liaison spécifique qui précipite efficacement l'ADN, et collecte ensuite de l'ADN de haute pureté à travers une colonne d'adsorption.

Ce kit est largement utilisé pour les tissus végétaux et les champignons, capable d'extraire l'ADN total d'échantillons à l'intérieur 2 heures (y compris l'ADN mitochondrial et l'ADN chloroplastique). L'ADN extrait peut être directement utilisé pour des expériences en aval telles que RAP, Southern Blot, et d'autres.

5. Principes et procédures expérimentaux

6. Processus d'extraction

Précautions avant de commencer l'expérience:

1. Tampons réactifs A et C peut précipiter dans des conditions de basse température. Il est recommandé de chauffer à 65°C pendant 5 minutes et utiliser après dissolution des précipités.
2. LaverTampon 1 doit contenir la quantité spécifiée d'éthanol anhydre ajoutée, comme indiqué sur l'étiquette de la bouteille.. Marquez l'étiquette une fois l'éthanol ajouté.
3. Le tampon d'élution est un 0.1x solution TEcontenant un minimum d'EDTA. Si l'EDTA affecte les expériences ultérieures, de l'eau désionisée stérile est recommandée comme substitut au tampon d'élution.

1. Manipulation des échantillons:
2. Collecte et stockage des matériaux:

Matériel fraîchement collecté, s'il n'est pas utilisé immédiatement, doit être placé dans de l’azote liquide et finalement conservé à -80°C. Les matériaux séchés peuvent être stockés à température ambiante.

1. Si possible, collecter des matières fraîches car elles contiennent moins de polysaccharides et de polyphénols.
2. Lors de la collecte de champignons à partir d'une culture liquide, séparer le liquide par centrifugation et récupérer les corps fongiques.
3. Broyer autour 100 mg d'échantillons frais ou pas plus de 20 mg de matière sèche utilisant de l'azote liquide.

(Note: Différentes quantités d'échantillons peuvent nécessiter une optimisation via des expériences préliminaires avant utilisation.)

3. Ajouter 550 µl de tampon réactif A et 10 µl de RNase A (10 mg/ml) pour s'assurer qu'il n'y a pas d'amas de tissus dans l'échantillon broyé. Les amas de tissus sont difficiles à lyser et peuvent réduire le rendement en ADN. Ne pas mélanger tampon réactif A et RNase AAvant utilisation.
4. Incuber à 65°C pendant 20-30 minutes, inverser doucement 2-3 fois. Cette étape concerne la lyse cellulaire.
5. Centrifuger le lysat pour 5 minutes à 14,000 tr/min (20,000×g).

(Note: Certaines matières végétales peuvent contenir beaucoup de substances collantes à cette étape, qui peut cisailler l'ADN dans les étapes suivantes. Idéalement, éliminer ces substances en transférant le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger après centrifugation.)

6. Transférez délicatement le liquide obtenu à l’étape précédente dans un nouveau tube à centrifuger.

(Note: Environ 500 μl de liquide peut être transféré; pour certaines espèces, c'est peut-être moins que 500 µl.)

7. Ajouter un volume égal de chloroforme au lysat et inverser délicatement pour mélanger.

(Note: Par exemple, ajouter 500 μl de chloroforme si vous avez 500 µl de lysat. Si le volume du lysat est inférieur à 500 µl, ajuster le volume de chloroforme en conséquence.)

8. Centrifuger à 12,000 tr/min pour 10 minutes.
9. Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger (environ 500 µl).
10. Ajoutez un volume égal de tampon réactif C et un volume égal d'éthanol anhydre au lysat, et mélanger.

(Par exemple, si tu ajoutes 450 µl de tampon réactif C, puis ajouter 450 µl d'éthanol anhydre. Si le volume du lysat est inférieur à 450 µl, réduire proportionnellement la quantité de tampon réactif C. Une certaine précipitation se produira lors de l’ajout du tampon réactif C, mais cela n'affectera pas les expériences ultérieures.)

11. Transférer le liquide obtenu dans une colonne de purification d'ADN (trousse), environ 650-700 µl à chaque fois. Centrifugeuse à plus 8,000 tr/min pour 1 minute, jeter les déchets collectés, et réinsérez le tube de prélèvement dans la colonne de purification pour l'étape suivante.
12. Répétez l'étape 11, ajouter le liquide restant à la colonne de purification d'ADN (trousse) et centrifuger à plus de 8,000 tr/min pour 1 minute. Jeter les déchets et le tube de collecte.
13. Placer la colonne de purification d'ADN (trousse) dans un nouveau tube de collecte, ajouter 300 µl de Laver Tampon 1, centrifuger à plus 8,000 tr/min pour 1 minute, jeter les déchets, et réinsérez la colonne de purification d'ADN (trousse) dans le tube pour la prochaine étape.

(Note: Assurez-vous que de l'éthanol anhydre a été ajouté à Laver Tampon 1.)

14. Ajouter 500 µl de tampon de rinçage 1 à la colonne de purification d'ADN (trousse), centrifuger à 14,000 tr/min (20,000×g) pour 2 minutes, prolonger légèrement le temps de centrifugation pour une membrane plus sèche.
15. Placer la colonne de purification d'ADN (trousse) dans un nouveau tube à centrifuger, ouvrir, et chauffer à 65°C pendant 2 minutes. Cette étape peut être prolongée pour évaporer l'éthanol autant que possible afin d'éviter que l'éthanol résiduel n'affecte les expériences en aval..
16. Goutte 100 µl de tampon d'élutionsur la membrane, centrifuger à 12,000 tr/min pour 2 minutes.

(Note: 1. Élution de l'ADN avec 50 Le tampon d'élution µl peut augmenter la concentration d'ADN mais diminuer le rendement total en ADN. 2. L'éluat peut être réappliqué dans la colonne de purification d'ADN pour une seconde élution., centrifuger à 12,000 tr/min pour 2 minutes pour collecter, ce qui peut améliorer le rendement en ADN.)