Note: Prélevez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test.
Équipement d'exploitation: Spectrophotomètre
Chat non: BC1190
Taille: 50T/24S
Composants:
| Réactif | Montant | Stockage | Préparation |
|---|---|---|---|
| Extraire la solution | 30 mL × 1 | 4°C | – |
| Réactif I | Poudre × 2 | 4°C | Ajouter 3.3 mL de Diluant à dissoudre lors de son utilisation. |
| Réactif II | 10 µL × 1 | 4°C | Diluer avec 2 μL de réactif II et 10 mL d'eau distillée avant utilisation. |
| Réactif III | 60 mL × 1 | 4°C | Dissoudre le fond cristallisé au bain-marie à 50°C. Utiliser du surnageant si le fond reste cristallisé. |
| Réactif IV | 30 mL × 1 | 4°C | – |
| Réactif V | 10 mL × 1 | 4°C | – |
| Standard | Poudre × 1 | 4°C | Ajouter 0.405 mL d'eau distillée pour 10 mg de glutathion réduit (GSH) lorsqu'elle est utilisée. |
| Diluant | 20 mL × 1 | 4°C | – |
Description du produit:
- Glutathion peroxydase (GPX), également connu sous le nom de GSH-Px ou GPX, est une enzyme peroxydase cruciale largement présente dans le corps.
- Le GPX joue un rôle important dans la catalyse de la conversion du glutathion réduit (GSH) au glutathion oxydé (GSSG) et en réduisant le peroxyde d'hydrogène toxique en composés hydroxyles non toxiques.
- L'action enzymatique du GPX implique l'oxydation du GSH par le peroxyde d'hydrogène, aboutissant à la production de GSSG.
- Le GSH réagit avec le DTNB pour former des composés présentant des pics d'absorption caractéristiques à 412 nm.
- La diminution de l'absorbance à 412 nm sert d'indicateur de l'activité GPX.
Réactifs et équipements requis mais non fournis:
Spectrophotomètre, équilibre, centrifugeuse de table, 1 Cuvette en verre ml, mortier/homogénéisateur, Tube EP.
Procédure
je. La préparation des échantillons:
Tissu:
Rapport de concordance Poids des tissus (g): Extraire la solution (ml)=1:5~10 (Suggéré 0,05 g de tissu avec 1 ml de solution d'extrait), homogénéiser sur bain de glace. Centrifuger à 5000 tr/min à 4℃ pendant 10 minutes, prends le surnageant, et placez-le sur la glace pour tester (Si le surnageant n'est pas clair, centrifugeuse pour 3 minutes).
Bactéries ou cellules
Quantité de cellules (104): Extraire la solution (ml): 500~1000:1 (Ajouter 1 ml de solution d'extrait à 5 millions de cellules), ultrasons avec bain de glace pour briser les cellules(300W,3s, intervalle 7s,temps total 3 minutes). Centrifugé à 5000 tr/min à 4℃ pendant 10 minutes, prenez le surnageant et placez-le sur la glace pour le tester (Si le surnageant n'est pas clair, centrifugeuse pour 3 minutes).
Échantillon de sérum: Détecter directement
II. Détermination procédure:
- Préchauffer le spectrophotomètre pendant 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 412 nm, et mettre à zéro avec de l'eau distillée.
- La solution standard de 20 μmol/mL a été dilué à 0.25 µmol/mL avec la solution d'extraction. La solution standard de 100 µL est mélangé avec 400 µL de réactif IV, et la concentration de la solution étalon était 0.05 µmol/mL. La solution étalon est préparée lorsque le mélange de solutions est utilisé.
- Mélangez le 150 µL d'échantillon avec le 150 µL de réactif I et placez-le à température ambiante pendant 5 minutes.
- Tableau d'opération: (1.5 Tube à centrifuger mL avec les réactifs suivants tour à tour).
| Nom du réactif(µL) | Tube à essai (T) | Tube de commande (C) |
| Échantillon de surnageant | 100 | – |
| Réactif I | 100 | 100 |
| Préchauffer pendant 5 minutes à 37℃ | ||
| Réactif II | 50 | 50 |
| Réaction pour 5 minutes à 37℃ | ||
| Réactif III | 1000 | 1000 |
| Exemples de mélanges | – | 100 |
Centrifuger à 4000 tr/min à température ambiante pendant 5 minutes et prélever le surnageant dans un tube EP.
| Nom du réactif(µL) | Tube à essai (T) | Tube de commande (C) | Tube standard (S) | Tube noir (B) |
| Diluant | – | – | – | 500 |
| Surnageant | 500 | 500 | – | – |
| Mélanges standards | – | – | 500 | – |
| Réactif IV | 500 | 500 | 500 | 500 |
| Réactif V | 125 | 125 | 125 | 125 |
Bien mélanger. Puis placé à température ambiante pendant 15 minutes, l'absorbance à 412 nm est mesuré. L'absorbance est enregistrée comme AT, CA, COMME, et AB, respectivement. Calculer ΔAT = AC – À, ΔAS= AS – UN B.
III. Calcul:
Calcul du pourcentage d'inhibition Pourcentage d'inhibition =(UN CHAT)/(UN TAXI)×100 %
Le plus loin possible, le pourcentage d'inhibition de l'échantillon est dans la plage de 30-70%, et plus on se rapproche de 50%, plus c'est précis. Si le pourcentage d'inhibition est inférieur à 30% ou plus que 70%, il est généralement nécessaire d'ajuster la posologie et de la re-déterminer. Si le pourcentage d'inhibition est élevé, l'échantillon doit être dilué correctement. Si le pourcentage d'inhibition est faible, l'échantillon avec une concentration élevée doit être préparé à nouveau.
Calcul de l'activité GPX
- Concentration en protéines:
Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse l'oxydation de 1 nmol de GSH par minute dans le système réactionnel., chaque milligramme de protéine.
GPX (U/mg prot) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(Cpr×VSV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷Cpr
- Poids de l'échantillon
Définition de l'unité: Une unité d’activité enzymatique est définie comme la quantité d’enzyme qui catalyse l’oxydation de 1 nmol de GSH par minute dans le système réactionnel, chaque gramme d'échantillon.
GPX (U/g poids) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(VSV÷VTV×W)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷W
- Quantité de cellules
Définition de l'unité: Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse l'oxydation de 1 nmol de GSH par minute dans le système réactionnel., chaque 104 cellules.
GPX(U/104cellule) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(N×VSV÷VTV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷N
- Volume de liquide:
Définition de l'unité: Une unité d’activité enzymatique est définie comme la quantité d’enzyme qui catalyse l’oxydation de 1 nmol de GSH par minute dans le système réactionnel, chaque millilitre de liquide.
GPX (U/mL)=ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷VS÷T=200×ΔAT÷ΔAS.
CS: Concentration des mélanges standards, 0.08 µmol/mL;
VÉV: Volume du système de réaction enzymatique, 1.25ml;
Vsv: Volume d'échantillon contenu dans les mélanges d'échantillons, 0.1 ml; VTV: Volume de la solution d'extraction, 1 ml;
Cpr: Concentration en protéines du surnageant, mg/ml;
T: Temps de réaction, 5 minutes;
N: La quantité de cellules, des dizaines de milliers; W: Poids de l'échantillon, g;
1000: 1 µmol=1000 nmol.
Note:
- Lorsque l'absorbance est supérieure à 1.2, il est suggéré que l'échantillon soit déterminé après dilution avec l'extraction
- Il est recommandé de ne pas prélever trop d'échantillons à la fois, pour éviter l'influence d'un temps de test trop long sur le développement des couleurs, ce qui peut laisser la détermination n'est pas
Instances expérimentales：
- Prendre 0,1 g de foie de souris, ajouter 1 ml de solution d'extrait, homogénéiser, et broyer. Prenez le surnageant, diluez-le par 40 fois, et tester en fonction des mesures Calculer AT=0,108, CA=0,303, AS=0,491AB=0,033,∆AT=AC-AT=0,195 ∆AS= AS-AB=0,458, calculer l'activité enzymatique en fonction du poids de l'échantillon:
GPX (U/g poids)=200×ΔAT÷ΔAS÷W×40（taux de dilution）=34061 U/g.
- Prendre 1g de feuille de peuplier, ajouter 1 ml de solution d'extrait, homogénéiser, et broyer. Calculer AT=0,220, CA=0,318, AS=0,491, AB=0,033, ∆AT=AC-AT=0,098,∆AS=AB-AB=0,458, calculer l'activité enzymatique en fonction du poids de l'échantillon:
GPX (U/g poids)=200×ΔAT÷ΔAS÷W=428 U/g.
Commentaires
Il n'y a pas encore de critiques.