Solarbio Lactate Déshydrogénase (LDH) Kit de test d'activité

Lactate déshydrogénase (LDH) Kit de test d'activité

Note: Prenez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test.

Équipement d'exploitation: Spectrophotomètre/lecteur de microplaques

Chat non: BC0685

Taille:100T/48S

Composants:

Extraire la solution: 60 mL×1. Stockage à 4℃；

Réactif I: 7 mL×1. Stockage à 4℃.

Réactif II: poudre × 1. Stockage à -20℃. Solution de travail: dissoudre avec 1.3 mL d'eau distillée avant utilisation. Il peut être divisé en tubule après appariement, qui se conserve deux semaines à -20℃. Évitez les cycles de congélation et de décongélation répétés.

Réactif III: 7 mL×1. Stockage à 4℃.

Réactif IV: 25 mL×1. Stockage à 4℃.

Solution étalon de pyruvate de sodium: 1 ml (2 µmol/mL) ×1. Stockage à 4℃.

Description du produit:

Lactate déshydrogénase (LDH ou LD) est l'enzyme terminale de la voie de la glycolyse que l'on retrouve dans presque toutes les cellules vivantes (animaux, plantes, et les procaryotes). La LDH catalyse la conversion du lactate en acide pyruvique et inversement, car il convertit le NAD+ en NADH et inversement.

Le NAD+ et l'acide lactique sont oxydés en acide pyruvique par la catalyse de la LDH. Le pyruvate a ensuite réagi avec le 2,4-dinitrophénylhydrazide pour former du pyruvate dinitrobenzone, qui présentent une couleur rouge brun en solution alcaline et la profondeur de la couleur est proportionnelle à la concentration de pyruvate.

Réactifs et équipements requis mais non fournis:

Spectrophotomètre/Lecteur de microplaques, bain-marie thermostaté, centrifugeuse de bureau, pipette réglable, cuvette en verre micro/plaque à fond plat de 96 puits, mortier/homogénéisateur, glace, eau distillée.

Procédure:

je. Échantillon préparation:

1. Bactéries, cellules, ou un échantillon de tissu:

Bactéries ou cellules:

Collecte de bactéries ou de cellules dans le tube à centrifuger. Le liquide de la couche supérieure est éliminé après centrifugation. Le rapport bactéries/quantité de cellules (104): Extraire le volume de la solution (ml) est 500~1000:1(il est suggéré de prendre environ 5 millions de bactéries/cellule et ajoutez 1 mL de solution d'extrait). Les bactéries et les cellules sont divisées par ultrasons (placé sur la glace, 200W, temps de travail 3s, intervalle 10s, répéter pour 30 fois). Centrifuger à 8000 tr/min 4℃ pour 10 minutes, prenez le surnageant et mettez-le sur la glace pour le test.

Tissu:

L'homogénéité du bain de glace est réalisée en fonction du rapport de la masse tissulaire (g): Extraire le volume de la solution (ml) = 1: 5~10 (il est recommandé de prendre environ 0.1 g de mouchoir et ajouter 1 mL de solution d'extrait). Homogénéisation par bain de glace. Centrifuger à 8000 tr/min et 4℃ pour 10 minutes, prenez le surnageant et mettez-le sur la glace pour le test.

2. Sérum (plasma)échantillon:

Détecter directement l'échantillon.

II. Procédure:

1. Préchauffer le spectrophotomètre/lecteur de microplaques 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 450 nm, mettre à zéro avec de l'eau distillée.
2. Solution étalon de pyruvate de sodium: prendre 100 µL de solution étalon, diluer pour 1, 5, 0.25, 0.125, 0 µmol/mL, et utiliser 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0 μmol/mL comme courbe standard.

3. Exemple de test

Bien mélangé, placer à température ambiante pendant 3 minutes. Prendre 200 μL de solution réactionnelle dans une microcuvette en verre/plaque à fond plat de 96 puits, mesuré l'absorbance à 450 nm, ΔA=AT-AC. Chaque tube à essai doit définir un tube de contrôle.

III. LDH Calculs.

1. Échantillon de teneur en pyruvate de sodium
2. Définir la courbe standard, axe y comme concentration standard, µmol/mL, l'axe des x comme 450 absorption nm. Mettre ΔA(X) en courbe standard, calculer y(µmol/mL)
3. Sérum (plasma) exemple d'activité LDH

Définition de l'unité: Une unité d’activité enzymatique est définie comme la quantité d’enzyme catalysant la production de 1 nmol d'acide pyruvique par minute, chaque millilitre de sérum.

LDH(U/mL)=y÷T×103=66,7×y

4. Tissu, activité LDH de bactéries ou de cellules en culture

UN. Concentration en protéines:

Définition de l'unité: Une unité d’activité enzymatique est définie comme la quantité d’enzyme catalysant la production de 1 nmol d'acide pyruvique par minute, chaque milligramme de protéine.

LDH(U/mg prot)= y÷T÷Cpr×103 =66,7×y÷Cpr

B. Poids de l'échantillon

Définition de l'unité: Une unité d’activité enzymatique est définie comme la quantité d’enzyme catalysant la production de 1 nmol d'acide pyruvique par minute, dans chaque gramme de tissu. LDH(U/g)= y÷T÷W×103 =666,7×y

C. Quantité de cellules

Définition de l'unité: Une unité d’activité enzymatique est définie comme la quantité d’enzyme catalysant la production de 1 nmol d'acide pyruvique par minute toutes les 10000 cellules.

LDH(Cellule U/104)= y÷T÷500×103 =0,133×y

Contre: Volume surnageant (ml), 0.01 ml; Vsv: Extraire le volume de la solution, 1 ml; T: Temps de réaction, 15 minutes;

Cpr: Concentration de protéines de l'échantillon, mg/ml; W: Poids de l'échantillon, 0.1 g;

500: Nombre total de bactéries ou de cellules, 5 million; 103: 1 µmol/mL=103 nmol/mL.

Les références

[1] Huang P.H., f, Huang C S, et autres. L'absorption de l'oligogalacturonide et son effet sur l'inhibition de la croissance, activité lactate déshydrogénase et libération de galactine-3 par des cellules cancéreuses humaines[J.]. Chimie alimentaire, 2012, 132(4): 1987-1995.

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