Glutathion oxydé Solarbio (GSSG) Kit d'analyse de contenu

Glutathion oxydé (GSSG) Kit d'analyse de contenu

Note: Prenez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test.

Équipement d'exploitation: Spectrophotomètre/lecteur de microplaques

Numéro de catalogue: BC1185

Taille:100T/96S

Composants:

Réactif I:100 mL×1. Stockage à 4℃. Réactif II: 130 µL×1. Stockage à 4℃. Réactif III: 20 mL×1. Stockage à 4℃. Réactif IV:2.5 mL×1. Stockage à 4℃.

Réactif V: Poudre ×1. Stockage à 4℃. Dissoudre avec 2.5 mL d'eau distillée lorsque la solution sera utilisée, puis divisé en paquets plus petits, grand à -20℃.

Réactif VI:12.5 µL×1. Stockage à 4℃. Préparer le réactif VI et l'eau distillée en fonction de la taille de l'échantillon dans le rapport de 1:20 (V: V) Avant utilisation.

Standard: Poudre 10 mg×1. Stockage à 4℃.

Description du produit

Glutathion oxydé(GSSG) est une forme oxydée du glutathion (GSH), également connu sous le nom de dithioneglutathion, formé par l'oxydation de deux molécules de glutathion. Le GSSG est réduit en GSH par la glutathion réductase, donc la majeure partie du corps est sous forme réduite. La détermination de la teneur en GSH et GSSG et du rapport GSH/GSSG dans les cellules peut refléter le statut redox des cellules.. Ce kit utilise la réaction du glutathion et 5, 5′-acide dithiobis-2-nitrobénoïque (DTNB) produire du 5-thio-2- acide nitrobenzoïque. 5-thio-2- L'acide nitrobenzoïque a la plus grande absorption à une longueur d'onde de 412 nm, et la 2-vinylpyridine inhibent le glutathion réduit dans l'original des échantillons, puis en utilisant la glutathion réductase pour réduire le GSSG en GSH, déterminer la teneur en glutathion oxydé.

Spécifications techniques

Limite minimale de détection：3.211 µg/mL

Plage linéaire：3.9-125 µg/mL

Réactifs et équipements requis mais non fournis.

Balance analytique, mortier/homogénéisateur, centrifugeuse réfrigérée, bain d'eau, pipette réglable, spectrophotomètre/lecteur de microplaques, cuvette en verre micro/plaque à fond plat de 96 puits.

Procédure

je. Échantillon préparation

1. 1. Échantillon de tissu

Laver les mouchoirs frais avec du PBS deux fois, puis ajouter 0.1 g d'échantillon dans l'homogénéisateur (l'homogénéisateur a été rincé avec le Réactif I et placé sur la glace avant utilisation). Ajouter 1 mL de réactif I (la proportion de tissus et de réactifs peut être maintenue constante), broyer complètement sur la glace (l'utilisation d'azote liquide aura un meilleur effet de broyage). Centrifuger à 8000 ×g et 4℃ pour 10 minutes, prenez le surnageant et placez-le à 4℃ pour le test. (Le surnageant peut être conservé à -80℃ pendant 10 jours.)

2. Échantillon de sang

Plasma: L'échantillon est centrifugé à 600 ×g et 4℃ pour 10 minutes. Absorber le plasma supérieur dans un autre tube, ajouter avec le même volume de réactif I. Centrifuger à 8000 ×g et 4℃ pour 10 minutes, prenez le surnageant et placez-le à 4℃ pour le test. (Le surnageant peut être conservé à -80 ℃ pendant 10 jours.)

Cellule sanguine:L'échantillon est centrifugé à 600 ×g et 4℃ pour 10 minutes. Jeter le plasma supérieur, laver avec un volume triple de PBS pendant 3 fois (mélanger les cellules sanguines avec une centrifugeuse PBS à 600 ×g pour 10 minutes), ajouter un volume égal de réactif I. Après avoir mélangé, il est placé à 4℃ pour 10 minutes. Centrifuger à 8000 ×g pour 10 minutes, prenez le surnageant et placez-le à 4℃ pour le test. (Le surnageant peut être conservé à -80℃ pendant 10 jours.)

3. Échantillon de cellules

La cellule de récolte ne doit pas être inférieure à 106, puis laver avec du PBS deux fois (mélanger la cellule avec une centrifugeuse PBS à 600 × g pendant 10 minutes), mélanger la cellule précipitée avec le volume de PBS pour 3 fois. Congélation et décongélation répétées 2 à 3 fois (suggérer congelé dans l'azote liquide, dissous dans un bain-marie à 37 ℃). Centrifuger à 8000 ×g pour 10 minutes, prenez le surnageant et placez-le à 4℃ pour le test. (Le surnageant peut être conservé à -80℃ pendant 10 jours.)

II. Procédure

1. Préchauffer le spectrophotomètre/lecteur de microplaques pour 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 412 nm, remettre le compteur à zéro avec du distillé
2. Préchauffer le réactif II au bain-marie pendant 30 minutes: 37℃ (cellule de mammifère) ou 25 ℃ (autres espèces).
3. La dilution standard: dissoudre l'étalon avec 1 mL d'eau distillée (4℃) à une concentration de 10 mg/ml. Prendre une solution adaptée pour préparer l'étalon de concentration de 125μg/mL、 5µg/mL、31.25µg/mL、15.625µg/mL、7.8125µg/mL、3.90625μg/mL et 0 μg/mL (Le diluant est un réactif I dilué dix fois).

4. Ajouter 20 μL d’étalon ou d’échantillon dilué à 0.5 Tube à centrifuger ml, ajouter 1 µL de réactif II, incuber à 37 ℃ pour 30 minutes après le mélange.
5. Créer des courbes standards

Après l'incubation, ajouter 140 µL de réactif III, 20 µL de réactif IV, 20µL de réactif V, et 2 μL de réactif VI dans le tube étalon en séquence. Après un mélange rapide, l'absorption lumineuse A1 et A2 de 30 sable 150 s respectivement ont été mesurés à 412 nm. Absorbance (A2-A1) est l'abscisse (X) et la concentration est l'ordonnée (oui), faire la courbe standard.

Ajouter 140 µL de réactif III, 20 µL de réactif IV, 20 µL de réactif V, et 2 μL de réactif VI dans les tubes d'échantillon dans l'ordre. Après un mélange rapide, l'absorption lumineuse A1 et A2 de 30 sable 150 s respectivement ont été mesurés à 412 nm, ΔA= A2- A1.

III. Calculs

Selon la courbe standard, échantillonner ΔA dans la formule (X), calculer la concentration de l'échantillon de y

(µg/ml).

• Concentration en protéines

GSSH (µg / mg prot)=y×Vrv÷Vrv÷Cpr =y÷Cpr

• Poids de l'échantillon

GSSH (µg/g)= y×Vrv÷(Vrv÷Vsv×W)= y÷W

• Montant de la cellule

GSSH (µg /106 cellule)= y×Vrv÷(Vrv÷Vsv×N)= y÷N

• Volume de solution

GSSH (µg / ml)= y×Vrv/Vs= 2y

N: Quantité de cellules,106；

Corde: Volume total de réaction, 0.203 ml；

Vsv: Le volume de surnageant a été ajouté dans le système réactionnel, 20 µL=0,02 mL； W: Poids de l'échantillon, g;

Cpr: Concentration en protéines du surnageant, mg/ml.

Remarques:

1. L'échantillon doit être complètement homogénéisé. Si le test ne peut pas être effectué temporairement, il peut être stocké à-80 ℃.
2. Si le contenu du GSSG dans l'échantillon est incertain, plusieurs gradients peuvent être dilués avant la mesure.
3. Cette méthode utilise la vitesse de réaction enzymatique pour calculer la concentration du substrat et effectuer les lectures aussi précisément que possible à 30 et 150
4. Le réactif I contenait un précipitant protéique, le surnageant n'a pas pu être utilisé pour la détermination de la concentration en protéines. Si la teneur en protéines doit être déterminée, prends un autre mouchoir.

Référence:

• Alpert A J, Gilbert H F. Détection du glutathion oxydé et réduit avec une réaction post-colonne de recyclage[J.]. Biochimie analytique, 1985, 144(2):553-562.
• Owens CWI, Belcher R Une micro-méthode colorimétrique pour le dosage du glutathion[J.]. Journal biochimique, 1965, 94(3): 705.

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