Introduction
- AFLP est une technologie de marqueur moléculaire de l'ADN qui détecte le polymorphisme de l'ADN en limitant la longueur des fragments produits par les endonucléases de restriction..
- Les principales caractéristiques de la technique AFLP sont:
- Nécessite une petite quantité d’ADN pour l’analyse, seulement 0,5g.
- Présente une bonne reproductibilité.
- Démontre un fort polymorphisme.
- Offre une haute résolution.
- Ne nécessite pas d'hybridation sudiste.
- Convient à une large gamme d'échantillons.
- Présente une hérédité stable.
- Au niveau des caractéristiques techniques, AFLP est un produit combinant RAPD et RFLP.
- Il surmonte les inconvénients de la complexité et des risques radioactifs de la technologie RFLP, et l'instabilité et la domination des marqueurs génétiques dans RAPD tout en intégrant les atouts des deux.
- Au cours des dernières années, cette technologie a été continuellement améliorée et développée, faisant de l'AFLP la méthode moléculaire la plus efficace à ce jour.
Le principe de l'AFLP
- AFLP est également une technologie de marqueur moléculaire de l'ADN qui détecte le polymorphisme de l'ADN en limitant la longueur des fragments produits par les endonucléases de restriction..
- Cependant, L'AFLP consiste à amplifier les fragments coupés par l'enzyme via RAP réaction d'abord, puis électrophorèse des fragments amplifiés coupés par l'enzyme sur un gel de séquençage haute résolution. Le polymorphisme est détecté en fonction des différentes longueurs des fragments amplifiés.
- Dans l'expérience, les fragments coupés par l'enzyme sont d'abord ligaturés à des adaptateurs artificiels contenant des extrémités cohésives compatibles. La séquence de ces extrémités cohésives, avec la séquence d'adaptateur, sert de site de liaison pour les réactions PCR ultérieures.
- En fonction des besoins, différentes amorces avec 1 à 3 des nucléotides sélectifs ajoutés aux extrémités peuvent être utilisés pour réaliser une amplification sélective. Ces nucléotides sélectifs permettent aux amorces de reconnaître sélectivement les fragments coupés par l'enzyme avec des séquences d'appariement spécifiques., conduisant à une amplification spécifique.
Réactif utilisé dans le test
| Réactifs expérimentaux | Description |
|---|
| Enzyme Taq | ADN polymérase |
| Adaptateurs EcoRI/MseI | Adaptateurs pour enzymes de restriction |
| Apprêts E+A | Amorces pour l'amplification PCR |
| Amorces M+C | Amorces pour l'amplification PCR |
| ADN ligase T4 | Enzyme ADN ligase |
| Oligonucléotides E et M | Oligonucléotides pour PCR |
| Agarose | Matrice de gel pour électrophorèse |
| Persulfate d'ammonium | Catalyseur pour le coulage de gel et la dénaturation de l'ADN |
| Acrylamide | Composant de matrice de gel pour le séquençage haute résolution |
| Urée | Agent dénaturant pour électrophorèse |
| Nitrate d'argent | Coloration pour visualiser les bandes d'ADN |
| Formamide | Agent dénaturant pour gels de séquençage d'ADN |
| dNTP | Désoxynucléotide triphosphates pour PCR |
| Xylène cyanol | Colorant de suivi pour électrophorèse |
| Acide acétique | Utilisé dans la préparation du gel |
| Verre silane | Agent de revêtement pour plaques de verre en électrophorèse sur gel |
| 50Marqueur de pb | Marqueur ADN de 50 paires de bases pour référence de taille |
Procédure expérimentale
1. Extraction et purification de l'ADN génomique
Se référer aux méthodes d'extraction d'ADN.
Purification de l'ADN:
- Électrophorèse de fragments d'ADN sur un 0.8% gel d'agarose (contenant 0,5 μg/ml de bromure d'éthidium, EB), sortir 1/3 de l'ADN génomique extrait pour purification.
- Premièrement, reconstituer le volume de l'ADN extrait avec du tampon TE jusqu'à un volume total de 50 µl.
- Extraire une fois avec du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) et une fois avec du chloroforme/alcool isoamylique (24:1). Centrifuger et transférer le surnageant dans un tube Eppendorf.
- Ajouter 1/10 volume de NaAc et deux fois le volume d'éthanol absolu pré-refroidi, et placer à -20°C pendant au moins 2 heures. Centrifuger à 10 000 g pendant 10 minutes.
- Laver le précipité d'ADN deux fois avec 70% éthanol, sécher à l'air, et se dissoudre dans 30 µl de tampon TE.
- Mesurez les valeurs A260 et A280 à l'aide d'un UV-2401PC (Shimadzu) Spectrophotomètre UV pour la quantification.
- Électrophorèse de fragments d'ADN sur un 0.8% gel d'agarose (contenant 0,5 μg/ml d'EB) pour la détermination de la taille.
Note:
- Pour 0,1 à 0,2 g de tissu, dissoudre dans 100μl de solution E. Pour 0,5 g de mouchoir, augmenter la solution E à 300μl. À ce point, la concentration en ADN est d'environ 100 ng/μl.
2. Digestion et ligature des enzymes de restriction
Dans un tube à centrifuger de 0,2 ml, ajouter:
- Environ 250 ng d'ADN modèle,
- 2.5μl 10× tampon de digestion par enzyme de restriction,
- 2.5µl 10 × tampon ADN ligase T4,
- 5 unités d'EcoRI,
- 5 unités de MseI,
- 2 unités d'ADN ligase T4,
- 50adaptateur pmol MseI,
- Eau bidistillée pour un volume total de 25μl.
Incuber le mélange dans un thermocycleur PCR réglé à 37°C pendant la nuit. Après digestion, inactiver les enzymes en incubant à 65°C pendant 20 minutes. Conserver la réaction à -20 °C pour une utilisation ultérieure comme modèle de pré-amplification.
3. Pré-amplification
Prendre 3μl du produit digéré et ligaturé par l'enzyme et ajouter:
- 75de l'apprêt E+A,
- 75ng d'amorce M+C,
- 15mM Mg2+,
- 25dNTP mM,
- 1 unité de Taq polymérase,
- 3µl de tampon PCR 10×,
- Ajouter de l'eau bidistillée jusqu'à un volume total de 30 μl.
Définissez les paramètres de la réaction PCR comme suit:
- Dénaturation initiale à 94°C pour 90 secondes,
- Dénaturation à 94°C pour 30 secondes,
- Recuit à 56°C pour 1 minute,
- Extension à 72°C pour 1 minute,
- Répétez les étapes ci-dessus pour 30 cycles,
- Extension finale à 72°C pour 10 minutes (en utilisant un Appareil PCR de la société PE).
Après la réaction, analyser les produits d'amplification par électrophorèse sur un 0.8% gel d'agarose (contenant 0,5 μg/ml d'EB). Prendre 3μl du produit et diluer 50 temps pour une utilisation ultérieure comme modèle pour l’amplification sélective.
4. Amplification PCR sélective
Prélever 3μl du produit dilué et ajouter:
- 75d'apprêt sélectif EcoRⅠ,
- 75d'amorce sélective MseⅠ,
- 15mM Mg2+,
- 25dNTP mM,
- 1 unité de Taq polymérase,
- 3µl de tampon PCR 10×,
- Ajouter de l'eau bidistillée jusqu'à un volume total de 30 μl.
Définissez les paramètres de la réaction PCR comme suit:
- Dénaturation initiale à 94°C pour 90 secondes,
- Dénaturation à 94°C pour 30 secondes,
- Recuit à 65°C pour 1 minute, puis effectuez 13 cycles (diminuer la température de 0,7°C par cycle),
- Dénaturation à 94°C pour 30 secondes,
- Recuit à 56°C pour 1 minute,
- Extension à 72°C pour 1 minute, puis effectuez 25 cycles,
- Extension finale à 72°C pour 5 minutes (en utilisant une machine PCR de la société PE).
D'abord, analyser les produits de l'amplification sélective par électrophorèse sur un 0.8% gel d'agarose (contenant 0,5 μg/ml d'EB).
5. Électrophorèse sur gel
Séparez les produits amplifiés à l'aide d'un 6% gel de polyacrylamide dénaturant (0.5mm épaisseur) et 1 × tampon d'électrophorèse TBE (Appareil d'électrophorèse de séquençage BIO-RAD).
- Retirez le peigne et pré-exécutez le gel à une puissance constante de 140 W pendant 30 minutes jusqu'à ce que la température atteigne 47-49°C. Assurez-vous d'éliminer l'urée de chaque puits.
- Pour les produits d'amplification sélective, ajouter un volume égal de tampon de chargement (98% formamide, 10mMEDTA, 0.25% xylène cyanol, 0.25% bleu de bromophénol) et dénaturer à 94°C pendant 5 minutes (en utilisant une machine PCR de la société PE). Après dénaturation, placer rapidement sur la glace jusqu'au chargement.
- Chargez 8 μl de chaque échantillon dans chaque voie. Initialement, faire fonctionner le gel à une puissance constante de 100W pendant environ 2 minutes pour concentrer rapidement les échantillons au fond des puits. Ajustez ensuite à une puissance constante de 60W, maintenir la température autour de 43°C, jusqu'à ce que le bleu de bromophénol atteigne environ 2/3 de la distance du haut du gel à la plaque de verre. Terminer l'électrophorèse.
6. Coloration à l'argent
- Solution de fixation: Ajouter 100 ml d'acide acétique glacial à 900 ml d'eau déionisée ou d'eau bidistillée.
- Solution de coloration: Dissoudre 1 g d'AgNO3 dans 1 L d'eau déminéralisée, puis ajouter 1.5 ml de 37% formaldéhyde.
- Développer une solution: Dissoudre 30g Na2CO3, 1.5 ml de 37% formaldéhyde, et 2 mg de thiosulfate de sodium dans 1 L d'eau déminéralisée.
- Après électrophorèse, placez la plaque de verre avec le gel dans un plateau en plastique pour la coloration à l'argent.
- Fixation: Ajouter la solution de fixation et agiter doucement sur un shaker pendant 30 minutes. Réserver la solution de fixation après fixation.
- Rinçage: Lavez le gel trois fois avec de l'eau déminéralisée pendant 2 minutes à chaque fois.
- Coloration: Placez le gel dans un bac à coloration et versez la solution de coloration (conservé à 4°C). Secouez doucement sur un shaker pendant 30 minutes. Après avoir rincé le gel avec de l'eau déminéralisée pendant 10 secondes, transférez-le sur le plateau de développement.
- Développement: Ajouter la solution de développement (conservé à 4°C) et secouez doucement jusqu'à ce que les bandes cessent d'augmenter.
- Terminaison: Ajoutez la solution de fixation utilisée à l'étape 2 et agiter quelques minutes. Rincer à l'eau distillée pendant plusieurs minutes une fois les résultats optimaux obtenus.
- Après avoir retiré les gouttelettes d'eau du gel et de la plaque de verre, placez-le sur une lightbox et photographié à l'aide d'un appareil photo numérique Nikon.
Résumé
Merci d'avoir fourni la procédure expérimentale AFLP complète! Si vous avez des questions ou avez besoin d'aide supplémentaire, n'hésitez pas à nous demander. Nous sommes heureux de vous fournir une assistance et des réponses.