Désoxyribonucléotide triphosphates (dNTP) sont des éléments essentiels du réaction en chaîne par polymérase (RAP). Les dNTP servent de éléments de base permettant à la réplication de l'ADN de se produire. Pendant RAP, Les dNTP permettent l’amplification de séquences d’ADN cibles. Comprendre ce que sont les dNTP et leur fonction est essentiel pour apprécier la PCR.
Que signifie dNTP??
dNTP signifie désoxyribonucléotide triphosphate. Les désoxyribonucléotides sont les monomères qui composent l'ADN. Chaque désoxyribonucléotide est composé de:
- Une base azotée: adénine (UN), thymine (T), cytosine (C), ou de la guanine (g).
- Une molécule de sucre désoxyribose.
- Un groupe triphosphate.
Le « désoxy’ le préfixe indique que le composant sucre est le désoxyribose plutôt que le ribose. Le désoxyribose n'a pas d'atome d'oxygène sur le 2′ carbone.
Le triphosphate fait référence aux trois phosphates attachés aux 5′ carbone sur le sucre. Le fait d'avoir trois groupes phosphate fait des dNTP des molécules à haute énergie.
Combien de types de dNTP?
Il existe quatre dNTP différents, un pour chacune des bases d'ADN:
- dATP – désoxyadénosine triphosphate
- dTTP –triphosphate de désoxythymidine
- dCTP –triphosphate de désoxycytidine
- dGTP –désoxyguanosine triphosphate
Ces quatre dNTP sont les éléments de base nécessaires à la synthèse de nouveaux brins d'ADN..
Que sont les dNTP en biologie?
En biologie, Les dNTP jouent un rôle central dans la réplication de l'ADN et la PCR:
Réplication de l'ADN
Pendant la réplication de l'ADN à l'intérieur des cellules, Les dNTP sont incorporés dans de nouveaux brins d'ADN au fur et à mesure de leur synthèse. L'hélice d'ADN double brin se déroule et se divise en deux brins simples. Chaque brin sert de modèle pour qu'un nouveau brin complémentaire soit réalisé.
L'ADN polymérase ajoute des dNTP complémentaires au brin matrice, liaison via l'appariement de bases. Alors que les bases s'associent, les squelettes sucre-phosphate des dNTP sont liés entre eux.
Cela continue jusqu'à ce que les deux nouveaux brins soient des copies complètes de la molécule d'ADN originale.. Les dNTP fournissent les composants nécessaires pour construire les nouveaux brins d'ADN.
Réaction en chaîne par polymérase
En PCR, Les dNTP remplissent la même fonction que lors de la réplication de l'ADN. La PCR imite la réplication de l'ADN cellulaire dans un tube à essai. La séquence d'ADN cible est copiée à plusieurs reprises à l'aide de cycles de chauffage et de refroidissement..
Dans chaque cycle, Les dNTP sont ajoutés par l'ADN polymérase pour construire de nouveaux brins complémentaires aux brins matrices séparés. Cela amplifie la région cible de manière exponentielle. Les dNTP permettent la synthèse rapide de milliards de copies du segment d'ADN.
La PCR ne pourrait pas se dérouler sans dNTP pour polymériser de nouveaux brins d'ADN.
Comment fonctionnent les dNTP en PCR?
Les dNTP sont un réactif essentiel qui permet l'amplification par PCR. Voici un aperçu du fonctionnement des dNTP à chaque étape de la PCR:
Dénaturation
Dans l'étape initiale de dénaturation, l'ADN double brin est chauffé jusqu'à 94-98°C. Les liaisons hydrogène entre les brins complémentaires se brisent, produisant deux molécules d'ADN simple brin.
Recuit
La température de réaction est abaissée à 50-65°C pour permettre le recuit de l'amorce.. Les amorces directes et inverses se lient aux séquences complémentaires flanquant la région d'ADN cible.
Extension/allongement
Dans cette étape, L'ADN polymérase ajoute des dNTP aux amorces, synthétiser de nouveaux brins complémentaires aux brins modèles. La température est portée à 72°C, la température idéale pour Taq polymérase activité enzymatique.
La Taq polymérase amène les dNTP en paire de bases avec les bases modèles exposées. Au fur et à mesure que chaque dNTP est ajouté, une liaison phosphodiester se forme entre celui-ci et le brin d'ADN en croissance.
Cela continue jusqu'à ce que la séquence complémentaire complète soit formée. Le résultat est deux nouvelles copies d'ADN double brin contenant la région cible.
Répétition
Le cycle thermique se répète – chauffage pour séparer les brins, refroidissement pour le recuit d'amorce, et extension médiée par la polymérase à l'aide de dNTP.
Chaque cycle double le nombre de copies d'ADN. Après 30-40 cycles, des millions de copies de la cible sont réalisées.
Les dNTP ajoutés à chaque phase d'extension permettent l'amplification exponentielle. Sans dNTP, les nouveaux brins d'ADN n'ont pas pu être synthétisés.
Que se passe-t-il si les dNTP sont exclus de la PCR?
Les dNTP sont essentiels et requis pour la PCR. Si les dNTP ne sont pas ajoutés au master mix PCR, la réaction échouera.
Sans dNTP, La Taq polymérase n'a pas de nucléotides à ajouter aux amorces. Donc, l'élongation de nouveaux brins d'ADN ne peut pas se produire. L'ADN cible ne sera pas du tout amplifié.
Laisser de côté les dNTP signifie que la PCR ne fonctionnera pas, période. Seules les amorces et l'ADN matrice resteront sans amplification.
Une réaction de contrôle dépourvue de dNTP peut être utile pour confirmer que la synthèse de l'ADN dépend des dNTP.. Mais normalement, l'omission complète des dNTP est un échec automatique de l'expérience PCR.
Pourquoi les ddNTP sont-ils utilisés dans le séquençage de l'ADN?
Dans les réactions de séquençage de l'ADN, désoxynucléotides légèrement modifiés appelés didésoxynucléotides (ddNTP) sont utilisés. Les ddNTP diffèrent en ce qu'ils contiennent un atome d'hydrogène sur les 3′ carbone plutôt qu'un groupe hydroxyle.
Ce 3′ l'hydrogène empêche la formation de la prochaine liaison phosphodiester. Lorsqu'un ddNTP est incorporé par l'ADN polymérase, l'extension du brin est terminée.
En utilisant un ratio de dNTP et ddNTP, une terminaison aléatoire se produit, générer des fragments d'ADN de différentes longueurs. Ceux-ci peuvent ensuite être séparés par taille pour reconstruire la séquence originale.
Les ddNTP permettent le séquençage de l'ADN en arrêtant brusquement la synthèse sur des bases spécifiques. Comparé aux dNTP normaux, Les ddNTP n'ont pas le 3′ groupe hydroxyle nécessaire pour poursuivre l’élongation du brin.
Quelle est la concentration typique de dNTP dans la PCR?
La concentration standard de dNTP dans une PCR est généralement 200 µM de chaque dNTP. Cela fournit un rapport optimal entre les dNTP et les matrices d'ADN pour une amplification efficace..
Un niveau de dNTP trop faible peut conduire à une amplification non spécifique et à des rendements insuffisants. Une valeur trop élevée peut réduire la précision et augmenter le nombre de produits non spécifiques..
200 µM par dNTP, pour un total de 800 µM dNTP, convient à la plupart des applications PCR. Plus ou moins peut être utilisé si nécessaire pour optimiser la réaction.
Pour les PCR longs, une concentration de dNTP plus élevée (500-1000 µM) peut améliorer les rendements pour l’amplification de cibles d’ADN plus longues.
Il est important de maintenir les quatre dNTP présents à des concentrations égales. Un rapport déséquilibré peut gêner la réaction.
Conclusion
Les dNTP sont les éléments constitutifs des nucléotides qui permettent l'amplification par PCR.. Ces composants incluent le dATP, dTTP, dCTP, et dGTP.
Dans chaque cycle PCR, Les dNTP sont incorporés par la Taq polymérase dans de nouveaux brins d'ADN complémentaires aux brins matrices. Cela permet un doublement exponentiel de la région d'ADN cible.
Les dNTP sont des réactifs essentiels pour la PCR. Sans dNTP, L'ADN polymérase ne peut pas synthétiser de nouvelles copies de la séquence cible. L'amplification dépend entièrement de la présence des quatre dNTP.
Comprendre le rôle des dNTP nous aide à comprendre comment la PCR parvient à produire des milliards de copies de segments d'ADN en quelques heures. En fournissant les substrats de base pour la réplication de l'ADN, Les dNTP sont au cœur de cette technique indispensable de biologie moléculaire.
