Qu’est-ce que le PCR-SSCP ?? Les applications et le guide complet

Avec le développement des techniques de biologie moléculaire, diverses méthodes de détection des structures génétiques et des mutations ont continuellement émergé. Surtout après l'avènement de RAP technologie, diverses techniques de détection de gènes combinées à la PCR ont propulsé les progrès de la recherche génétique. Techniques telles que le séquençage direct de produits PCR asymétriques, clivage de la ribonucléase (ARNase), et analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) sont devenus de puissants outils d’analyse génétique. Cependant, ces méthodes sont relativement lourdes à mettre en œuvre, ont des limites importantes, ou nécessitent des conditions expérimentales élevées, les rendant impropres aux laboratoires cliniques généraux.

Introduit dans 1989, PCR-SSCP (Polymorphisme de conformation simple brin) a fait l'objet d'améliorations et de raffinements continus, ce qui rend les choses plus simples, plus rapide, et une méthode plus sensible pour détecter les mutations génétiques. Il n'est pas seulement utilisé pour détecter des mutations ponctuelles et des délétions et insertions de séquences courtes, mais il est également utilisé dans la quantification de l'ADN., surveillance de la contamination croisée dans les expériences de diagnostic PCR, et enquêter sur les sources d’infection. En raison des avantages exceptionnels du SSCP, il a été largement appliqué ces dernières années.

Principes et caractéristiques du SSCP

• Découverte et concept de base:
  • ADN simple brin (ADNsb) les fragments présentent des conformations de repliement spatial complexes maintenues par des interactions intramoléculaires, principalement l'appariement de bases.
  • Un seul changement de base peut modifier significativement ou légèrement la conformation spatiale, entraînant différents modèles de migration dans le gel de polyacrylamide.
• Mécanisme de séparation:
  • Électrophorèse sur gel de Polyacrylamide non dénaturant (PAGE) peut séparer nettement les molécules d'ADNsb avec des conformations différentes en raison de différents niveaux d'obstruction dans le gel.
• Analyse SSCP:
  • Polymorphisme de conformation monobrin nommé (SSCP) par le chercheur japonais Orita et ses collègues.
  • Appliqué pour détecter les mutations génétiques dans les produits amplifiés par PCR, améliorer la simplicité et la sensibilité.
• Processus de base:
  1. Amplification PCR: Amplifier l'ADN cible.
  2. Dénaturation et renaturation: Dénaturer les produits de PCR spécifiques et les renaturer rapidement pour former des molécules d'ADN simple brin avec des structures spatiales spécifiques.
  3. PAGE non dénaturante: Effectuer une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide non dénaturant sur une quantité appropriée d'ADN simple brin.
  4. Détection: Analyser les résultats par autoradiographie radiographique, coloration à l'argent, ou coloration au bromure d'éthidium.
• Interprétation:
  • Un changement dans le taux de migration de l'ADNsb par rapport au contrôle normal indique un changement de conformation, suggérant une mutation de base dans ce fragment d'ADN.
• Avantages:
  • Simple, rapide, et méthode sensible.
  • Ne nécessite pas d'équipement spécialisé.
  • Convient aux laboratoires cliniques.
• Limites:
  • Détecte uniquement les mutations; un séquençage supplémentaire est nécessaire pour identifier la position exacte et le type de mutation.
  • Conditions d'électrophorèse strictes requises.
  • Faux négatifs possibles si les mutations ponctuelles ne modifient pas de manière significative la conformation de l'ADN double brin ou si d'autres conditions interfèrent.
• Efficacité de détection:
  • Malgré les limites, SSCP bénéficie d'un taux de détection élevé par rapport aux autres méthodes.
  • Capable d'identifier des mutations de bases inconnues dans le fragment d'ADN cible.
  • Takao a démontré que SSCP peut détecter 90% de mutations monobase dans des fragments d'ADN plus courts que 300 pb.
• Autres applications:
  • Le SSCP peut séparer l'ADNsb mutant avec différents taux de migration par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
  • Permet une purification et une identification plus poussées des fragments d'ADN mutants au niveau de la séquence.

Développement et améliorations du SSCP

• Développement initial:
  • Initialement, Le SSCP impliquait l’incorporation d’isotopes dans des produits d’amplification PCR, et les résultats ont été affichés par autoradiographie. Cela a posé des défis pour une adoption généralisée.
• Simplification:
  • La combinaison de la coloration de l'ADN à l'argent avec la PCR-SSCP, en particulier l'application de la coloration directe au bromure d'éthidium, grandement simplifié la méthode.
• Améliorations notables récentes:
  • Analyse ARN-SSCP:
    • Le principe de base: L'ARN a des conformations secondaires et tertiaires plus complexes, ce qui le rend très sensible aux mutations monobase, augmentant ainsi les taux de détection.
    • Le taux de détection des mutations peut dépasser 90%.
    • L'ARN est moins susceptible de former des doubles brins, permettant d'utiliser une plus grande quantité en électrophorèse, ce qui est bénéfique pour la coloration au bromure d'éthidium.
    • Cependant, cette méthode ajoute une étape de transcription inverse et nécessite des amorces plus longues contenant des séquences promotrices de l'ARN polymérase, complexité croissante.
• Combinaison de SSCP avec d'autres méthodes de détection de mutations:
  • Analyse hétéroduplex (Il):
    • Améliore considérablement les taux de détection lorsqu'il est combiné avec SSCP.
    • Implique l’hybridation d’une sonde avec l’ADNsb ou l’ARN cible. Les brins hybrides contenant une paire de bases incompatibles peuvent être séparés des brins hybrides complètement complémentaires par électrophorèse sur gel PAG non dénaturant..
    • Effectuer à la fois des analyses SSCP et Het sur la même séquence cible peut atteindre un niveau proche. 100% taux de détection des mutations ponctuelles, tout en conservant la simplicité expérimentale.

La procédure du PCR-SSCP

Préparation du gel basée sur la longueur des fragments d'ADN

Pour les fragments d'ADN de moins de 1 Ko, choisir la concentration de gel de polyacrylamide comme suit:

• Longueur des fragments d'ADN (pb): % Concentration d'acrylamide
  • 1Ko–700b: 3.5%
  • 700b–500b: 5%
  • 500b-200b: 8%
  • 200b: 12%

Préparations pré-SSCP

• Amplification PCR: Amplifiez un produit spécifique avec un minimum de maculage (confirmé par électrophorèse sur gel d'agarose).

1. Préparation du gel de polyacrylamide (PAG)

• Préparez la solution de gel en fonction de la concentration requise dans le tableau ci-dessus.
• Insérez un peigne dans le moule à gel.
• Versez la solution de gel d'une extrémité du peigne, incliner le moule vers l'extrémité verseuse lorsque le gel atteint les dents du peigne pour éviter la formation de bulles.
• Laissez le gel se solidifier à température ambiante pendant 1 heure.
• Retirez le peigne et ajoutez 1 × tampon TBE sur le gel pour le recouvrir.

2. Électrophorèse

1. Prendre 10 µl de produit PCR.
2. Ajouter 10 µl d'agent dénaturant (95% formamide, 10 mmol/LEDTA, 0.02% bleu de bromophénol).
3. Ajouter 30 µl d'huile minérale.
4. Faire bouillir pendant 5 minutes, puis placer immédiatement dans un bain de glace pendant au moins 2 minutes.
5. Charger toute la phase aqueuse sur le gel.
6. Effectuer une électrophorèse à 10-15°C:
   • Commencez avec 300 V pour 5 minutes.
   • Continuez avec du 120 V pendant 8 heures.
7. Après électrophorèse, colorer le gel dans un tampon 1×TBE contenant 0.5 μg/ml de bromure d'éthidium pour 30-45 minutes.
8. Observer sous lumière UV ou procéder à une coloration à l'argent.

3. Coloration à l'argent

1. Laver le PAG deux fois avec de l'eau déminéralisée.
2. Fixer le gel dans une solution de 10% l'éthanol et 0.5% acide acétique pour 6 minutes.
3. Laver deux fois avec de l'eau déminéralisée.
4. Plongez dans 0.2% nitrate d'argent (AgNO3) solution pour 10 minutes.
5. Laver 3-5 fois avec de l'eau déminéralisée.
6. Développer dans une solution de 1.5% hydroxyde de sodium (NaOH) et 0.4% formaldéhyde pour 7 minutes.
7. Arrêtez le développement avec 0.75% le carbonate de sodium (NaCO3).

Applications du SSCP

Depuis qu'Orita et ses collègues ont utilisé le SSCP pour l'analyse du polymorphisme de l'ADN humain, la méthode a été largement utilisée dans divers domaines, y compris la détection de mutations génétiques associées au cancer et aux maladies héréditaires, ainsi qu'en typage de virus et en surveillance de la contamination.

Détection des mutations génétiques du cancer

• Mutations associées aux tumeurs:
  • Le SSCP est largement utilisé pour détecter des mutations dans des gènes liés à divers cancers tels que l'astrocytome, tumeurs cérébrales, cancer du poumon à petites cellules, cancer de l'estomac, et cancer colorectal.
  • Il a été appliqué pour détecter les mutations du gène P53 dans ces tumeurs et les mutations du gène ras dans le cancer du poumon..
• Candidatures réussies:
  • Récemment, Sugano et coll.. utilisé avec succès le SSCP coloré à l'argent pour détecter une mutation à la position 12 du gène c-Ki-ras2, terminer le processus d'électrophorèse et de coloration dans 2.5 heures.

Recherche sur les maladies héréditaires

• SSCP est utilisé dans l'étude des gènes impliqués dans des maladies héréditaires telles que:
  • Fibrose kystique: Détection de mutations dans le gène CFTR.
  • Type de neurofibromatose 1: Analyse des mutations génétiques.
  • Polypose adénomateuse familiale: Recherche génétique liée à cette maladie.
• ARN-SSCP vs. ADN-SSCP:
  • Sharkar et coll.. utilisé l'ARN-SSCP pour détecter des séquences de gènes dans 28 patients hémophiles B.
  • Comparaison avec l'ADN-SSCP et le séquençage direct des gènes révélé 20 mutations de base dans le gène du facteur IX de 2,6 Ko, avec détection d'ARN-SSCP 70% de ces mutations par rapport à 35% détecté par DNA-SSCP, démontrant une sensibilité plus élevée de l’ARN-SSCP.

Typage de virus et surveillance de la contamination

• Typage de virus:
  • SSCP est utilisé pour le typage des virus et la surveillance de la contamination dans les expériences PCR.
  • YaP a utilisé la PCR imbriquée pour détecter des échantillons de VHB provenant de différentes régions, suivi d'une analyse SSCP, qui a révélé des modèles SSCP distincts pour chaque échantillon, indiquant les variations régionales de l'ADN du VHB et éliminant la possibilité de contamination croisée.
• Surveillance des contaminations:
  • SSCP sert de méthode fiable pour garantir l’exactitude des résultats de diagnostic PCR.

Études sur la transmission des agents pathogènes

• SSCP est utilisé pour étudier les voies de transmission des agents pathogènes.

Analyse quantitative de l'ADN

• Analyse des cellules du cancer du sein:
  • SSCP, combiné avec un PCR compétitif, a été utilisé pour l'analyse quantitative des gènes mutants P53 dans les cellules du cancer du sein.
  • L’avantage de la méthode réside dans l’utilisation d’étalons internes qui diffèrent de l’ADN cible par une seule base., assurer des conditions d’amplification identiques et donc une quantification plus précise de l’ADN.

Précautions pour le SSCP

SSCP est un rapide, simple, et procédé sensible pour détecter des mutations génétiques. Pour obtenir des résultats optimaux, les précautions suivantes doivent être respectées:

Répétabilité:

• Les principaux facteurs affectant la répétabilité du SSCP sont la tension et la température de l'électrophorèse.. Garder ces conditions constantes garantit une bonne répétabilité des modèles SSCP.
• En général, Les modèles SSCP montrent deux bandes d'ADN simple brin, mais parfois, seulement une ou plus de trois bandes peuvent apparaître en raison de conformations spatiales similaires entre deux molécules d'ADN simple brin.. La présence de plus de trois bandes peut indiquer un mélange de fragments d'ADN sauvage et mutant..

Impact de la longueur de la séquence d'ADN cible:

• Le SSCP est plus efficace pour détecter les mutations ponctuelles dans des séquences d'ADN ou d'ARN plus courtes que dans des séquences plus longues.. Cela pourrait être dû au fait que les changements de base unique dans les molécules plus longues ont un impact moindre sur le maintien de la conformation spatiale..
• Certains chercheurs pensent que pour les chaînes d'ADN plus courtes que 400 pb, la longueur n’affecte pas l’efficacité du SSCP. Une sélection minutieuse des conditions expérimentales peut atteindre un taux de détection supérieur à 90% pour les mutations ponctuelles dans 354 Fragments d'ADN pb.

Tension et température d'électrophorèse:

• Maintenir des conformations spatiales stables de l’ADN simple brin, Le SSCP doit être effectué à des températures plus basses (généralement entre 4°C et 15°C). Haute tension au démarrage (250V) pour 5 minutes permet de séparer initialement l'ADN simple brin avec des conformations différentes sans augmenter significativement la température du gel. Cela devrait être suivi d'une tension plus basse (environ 100V) pour séparer davantage les brins.
• La tension exacte pour l'électrophorèse doit être déterminée en fonction de conditions expérimentales spécifiques.

Impact de la position de mutation ponctuelle:

• La position d'une mutation ponctuelle dans l'ADN ou l'ARN affecte les taux de détection du SSCP en fonction de son rôle dans le maintien de la conformation spatiale, plutôt que sa position linéaire sur la chaîne.
• Les mutations dans la région centrale de l’ADN sont généralement plus faciles à détecter que celles situées près des extrémités..
• Cependant, même les mutations dans la région centrale peuvent passer inaperçues si elles ne modifient pas de manière significative la conformation spatiale. Par exemple, L’étude de White a révélé que seulement 2 hors de 9 des échantillons présentant des mutations ponctuelles au niveau de la boucle d'une structure en épingle à cheveux ont été détectés, indiquant un taux de détection de 22%.

Interprétation des résultats SSCP:

• SSCP sépare l'ADN simple brin en fonction de la conformation spatiale plutôt que du poids moléculaire ou de la charge. Parfois, les taux de migration des chaînes normales et mutantes sont très proches, ce qui rend difficile de les distinguer.
• Typiquement, longueurs d'électrophorèse de 16-18 cm sont nécessaires pour déterminer avec précision les résultats en fonction de la limite de détection, qui est la plus petite différence de distance d'électrophorèse perceptible entre les fragments d'ADN mutants et normaux.
• Si la distance est supérieure à la limite de détection (par exemple., 3mm), une mutation est indiquée. Une distance plus petite ne suggère aucun changement. Définir une limite de détection basse peut conduire à des faux positifs.
• D'autres conditions, comme la quantité de produit PCR chargé, le degré de réticulation du PAG, et concentration du gel, doit être sélectionné en fonction d’exigences expérimentales spécifiques.

Détails du PCR-SSCP par étapes

La préparation des échantillons

1. Amplification et détection PCR:
   • Effectuer une amplification PCR à l'aide d'amorces appropriées et sélectionner la température d'hybridation appropriée.
   • Détectez les produits d'amplification en les exécutant sur un 2-2.5% gel d'agarose par électrophorèse horizontale. Charger 3-5 µl du produit PCR.
   • La concentration optimale du produit PCR doit être d'environ 10 ng/µl.
2. Mélange du produit PCR avec un tampon dénaturant:
   • Ajouter 5 µl de tampon d'échantillon SSCP (tampon dénaturant, same as the sequencing buffer in “Molecular Cloning”) au fond d'un tube PCR propre.
   • Ajouter le produit d'amplification PCR au centre du tampon. Ajustez la quantité en fonction de la visibilité de la bande sur le gel d'agarose:
     • Si le groupe est brillant, ajouter 1 µl.
     • Si le résultat est excellent, ajouter 0.5 µl.
     • Si le groupe n'est pas très clair, ajouter 1.5, 2, ou 3 µl en conséquence.
   • Augmenter proportionnellement la quantité de tampon d'échantillon, par exemple., pour 3 µl de produit PCR, ajouter 8 µl de tampon pour une meilleure dénaturation.
3. Dénaturation du produit PCR:
   • Centrifuger le tube pour concentrer l'échantillon au fond.
   • Dénaturer l'échantillon à 95°C pendant 10 minutes à l'aide d'un Appareil PCR, puis placez immédiatement le produit PCR sur de la glace pendant 5 minutes pour éviter la renaturation.

   Note: Pas 3 et 4 peut être réalisé après la quatrième étape de préparation du gel en attendant que le gel se solidifie.

Préparation du gel

1. Préparation des plaques de verre:
   • Rincer chaque paire de plaques de verre avec de l'eau du robinet puis du ddH2O.
   • Sécher les plaques de verre avec du papier absorbant puis essuyer avec de l'éthanol anhydre.
   • Laisser l'éthanol s'évaporer pendant 2-3 minutes.
   • Assemblez les plaques de verre et placez-les dans le support de coulée de gel, s'assurer que les deux côtés et le fond sont sécurisés.
   • Serrez les vis d'assemblage pour maintenir les plaques à niveau. (Vérifiez les fuites à l’aide d’éthanol anhydre.)

Grands gels (50% Concentration de glycérol)

Composant	8% Gel (10ml de gel inférieur)	8% Gel (5ml de gel d'empilement)	6% Gel (10ml de gel inférieur)	6% Gel (5ml de gel d'empilement)
30% PAGE	2.7ml	1ml
10× TBE	1ml	0.5ml
50% Glycérol	1ml	0.5ml
dH2O	5ml	3ml
APS	70µl	70µl
TEMÉD	12µl	8µl
Volume total	10ml	5ml

Petits gels (50% Concentration de glycérol)

Composant	8% Gel (15ml de gel inférieur)	8% Gel (10ml de gel d'empilement)	6% Gel (15ml de gel inférieur)	6% Gel (10ml de gel d'empilement)
30% PAGE (4°C)	4.05ml	2ml	2ml
10× TBE	1.5ml	1ml	1ml
50% Glycérol	1.5ml	1ml	1ml
dH2O	7.5ml	6ml	6ml
APS	105µl	70µl	70µl
TEMÉD	12µl	12µl	12µl
Volume total	15ml	10ml	10ml	5ml

Versage du gel

1. Mélanger le gel: Après avoir préparé la solution de gel selon la formulation fournie, bien mélanger pour assurer l'uniformité.
2. Verser dans des assiettes en verre: Versez délicatement la solution de gel préparée dans les plaques de verre assemblées. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnée pendant le processus de coulée. Si des bulles sont observées, inclinez doucement les plaques pour permettre aux bulles de remonter à la surface. Tapoter légèrement les côtés des plaques peut aider à libérer les bulles d'air emprisonnées.
3. Insertion du peigne: Une fois que le niveau de la solution gel atteint environ 0,5 cm sous le bord supérieur des plaques de verre, insérez le peigne dans le gel. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air coincées entre les dents du peigne et la surface du gel.. Si des bulles sont présentes, enlever le peigne, libérer les bulles, et réinsérez soigneusement le peigne.
4. Permettre la polymérisation du gel: Après avoir inséré le peigne, laisser le gel polymériser en plaçant les plaques à plat ou légèrement inclinées (moins que 10 degrés) sur une surface plane pendant environ 30 minutes. Pendant ce temps, le gel va polymériser et se solidifier.

Note: C'est également le moment approprié pour procéder à la dénaturation des échantillons PCR comme décrit dans les étapes 3 et 4 de la première section.

Chargement de gel

• Placer le gel:
  • Retirez le peigne du gel rapidement après la polymérisation.
  • Veiller à ce qu'une force uniforme soit appliquée pour maintenir l'intégrité des puits.
  • Fixez la plaque de gel sur l'appareil d'électrophorèse avec le côté du puits tourné vers l'intérieur..
  • Transition lente de la plaque de gel sur le tampon d'électrophorèse pour éviter les grosses bulles d'air.
• Pré-électrophorèse:
  • Ajoutez 1 × tampon d'électrophorèse TBE dans le réservoir supérieur jusqu'à ce que le niveau de liquide soit à environ 1 cm au-dessus du bord le plus court de la plaque de verre..
  • Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite du réservoir supérieur.
  • Réglez la tension sur 140-150 V pour le gros appareil et 110-120 V pour le petit appareil..
  • Pré-électrophorèse pendant environ 10 minutes.
• Chargement d'échantillon:
  • Ajouter séquentiellement les échantillons préparés dans les puits du gel à l'aide d'une microseringue.
  • Évitez de charger des échantillons dans les deux puits les plus proches des bords de chaque plaque de gel.
• Électrophorèse:
  • Réglez la tension sur 140-150 V pour le gros appareil et 110-120 V pour le petit appareil..
  • Effectuer une électrophorèse à une température de 10-15°C pendant au moins 10 heures.

Coloration

• Fixation:
  • Retirer le gel de l'appareil, marquer le point de départ, et plongez-le dans 70% éthanol pour 15 minutes sur un shaker.
  • Récupérer l'éthanol après fixation et rincer deux fois à l'eau distillée pendant environ 3 minutes par rinçage.
• Coloration:
  • Colorer le gel dans une solution de coloration (200ml contenant 3.6% NaOH 4,2 ml, 20% AgNO3 3,6 ml, ammoniaque 2ml) pour 30 minutes.
  • Ajustez le temps de coloration si vous colorez deux gels simultanément.
• Développement:
  • Développer le gel dans la solution de développement (200ml contenant 1% citrate de sodium 1 ml, formaldéhyde 100ul) jusqu'à ce que les bandes soient clairement visibles.
  • Rincer trois fois avec de l'eau distillée pendant 3 minutes chacun pour arrêter le développement.
  • Alternativement, colorer le gel en le plongeant dans un tampon TBE 1 × contenant 0,5 ug/ml de bromure d'éthidium pendant 10 minutes et visualiser sous lumière ultraviolette

Formules

10×Formule TBE:

• Base Tris: 108g
• Acide borique: 55g
• 0.5mol/LEDTA (pH 8.0), volume ajusté à 1L

Formule tampon dénaturante:

• 98% Formamide désionisé
• 10mmol/LEDTA (pH 8.0)
• 0.025% Xylène Cyanol FF
• 0.025% Bleu de bromophénol

Remarques:

1. Reproductibilité:
   • Le maintien d'une tension et d'une température stables pendant l'électrophorèse est le principal facteur affectant la reproductibilité du SSCP.
   • Typiquement, Les modèles SSCP montrent deux bandes d'ADN simple brin, mais parfois seulement une ou trois bandes ou plus peuvent apparaître, probablement dû à la présence de conformations tridimensionnelles similaires entre les fragments d'ADN de type sauvage et mutants.
2. Influence de la longueur de la séquence d'ADN cible:
   • Le SSCP a un taux de détection plus élevé pour les mutations ponctuelles dans l'ADN ou l'ARN à chaîne courte que dans l'ADN à chaîne longue. Cela est probablement dû au fait que les changements de bases individuelles dans les molécules d'ADN et d'ARN à longue chaîne ont un effet moindre sur le maintien des conformations tridimensionnelles..
   • Dans le cas de chaînes d'ADN plus courtes (en dessous de 400 pb), la longueur de l'ADN n'affecte pas l'efficacité du SSCP.
3. Effets de la tension et de la température de l'électrophorèse:
   • Maintenir une conformation tridimensionnelle stable de l’ADN simple brin, Le SSCP doit être effectué à une température plus basse (généralement entre 4°C et 15°C).
   • Pendant l'électrophorèse, une tension excessive peut provoquer une augmentation de la température. Donc, lors de l'exécution de SSCP dans une cuve d'électrophorèse sans dispositif de refroidissement, une tension plus élevée (250V) doit être utilisé initialement, suivi d'une réduction à environ 100V pour l'électrophorèse.
4. Interprétation des résultats du SSCP:
   • Dans l'analyse SSCP, la séparation des fragments d'ADN simple brin est basée sur la taille de leur encombrement stérique plutôt que sur le poids moléculaire, donc incapable de refléter le poids moléculaire.
   • L'interprétation des résultats doit être basée sur la limite de détection, qui fait référence à la différence minimale de distance électrophorétique entre les fragments d'ADN mutants et normaux pouvant être distingués.
5. autres considérations:
   • Conditions telles que la quantité de produit PCR chargée, la densité de réticulation du gel de polyacrylamide, et la concentration du gel doit être sélectionnée et déterminée en fonction de conditions expérimentales spécifiques.