Kit Ekstraksi DNA Genomik Tanaman Skala Kecil Metode CTAB

1. Komponen kit reagen

2. Penyimpanan

Kit ini harus disimpan pada suhu kamar (15-25℃) dalam kondisi kering dan dapat disimpan 12 bulan. Kolom pemurnian ekstraksi DNA dapat disimpan di lingkungan sejuk dan kering hingga maksimal 1 tahun. RNase A mengandung bahan pengawet dan dapat diangkut pada suhu kamar, tapi untuk penyimpanan jangka panjang, itu harus dijaga pada -20℃.

3. Petunjuk Penggunaan Kit Reagen

3.1 Kit ini ditujukan untuk tujuan penelitian biologi molekuler dan tidak boleh digunakan untuk diagnosis atau pengobatan penyakit.

3.2 Beberapa komponen dalam kit mengandung bahan pengiritasi; disarankan untuk mengambil tindakan pencegahan yang diperlukan (seperti memakai pakaian pelindung dan kacamata).

3.3 Penggunaan kit ini memerlukan peralatan tambahan seperti centrifuge berkecepatan tinggi, mandi air (mandi logam), pencampur pusaran, etanol anhidrat, nitrogen cair, khloroform, air deionisasi steril, dan tabung EP.

4. Pengantar Kit Reagen

Itu CTAB-tanaman berbasis Pemurnian DNA Kit menyediakan metode CTAB yang ditingkatkan untuk memurnikan DNA, menggunakan buffer pengikat spesifik yang secara efisien mengendapkan DNA, dan kemudian mengumpulkan DNA dengan kemurnian tinggi melalui kolom adsorpsi.

Kit ini banyak digunakan untuk jaringan tanaman dan jamur, mampu mengekstraksi total DNA dari sampel di dalamnya 2 jam (termasuk DNA mitokondria dan DNA kloroplas). DNA yang diekstraksi dapat langsung digunakan untuk eksperimen hilir seperti PCR, Blot Selatan, dan lain-lain.

5. Prinsip dan Prosedur Eksperimental

6. Proses Ekstraksi

Tindakan pencegahan sebelum memulai percobaan:

1. Buffer reagen A dan C dapat mengendap pada kondisi suhu rendah. Disarankan untuk memanaskan pada suhu 65°C 5 menit dan gunakan setelah endapan larut.
2. MencuciPenyangga 1 harus ditambahkan etanol anhidrat dalam jumlah tertentu seperti yang ditunjukkan pada label botol. Tandai label setelah etanol ditambahkan.
3. Buffer elusi adalah a 0.1x solusi TEmengandung minimal EDTA. Jika EDTA mempengaruhi percobaan selanjutnya, air deionisasi steril direkomendasikan sebagai pengganti buffer elusi.

1. Penanganan Sampel:
2. Pengumpulan dan Penyimpanan Bahan:

Bahan yang baru dikumpulkan, jika tidak segera digunakan, harus ditempatkan dalam nitrogen cair dan akhirnya disimpan pada suhu -80°C. Bahan kering dapat disimpan pada suhu kamar.

1. Jika memungkinkan, kumpulkan bahan segar karena mengandung lebih sedikit polisakarida dan polifenol.
2. Saat mengumpulkan jamur dari kultur cair, pisahkan cairan dengan sentrifugasi dan kumpulkan tubuh jamur.
3. Giling 100 mg sampel segar atau tidak lebih dari 20 mg bahan kering menggunakan nitrogen cair.

(Catatan: Jumlah sampel yang berbeda mungkin memerlukan optimasi melalui percobaan awal sebelum digunakan.)

3. Menambahkan 550 μl buffer reagen A dan 10 μl RNase A (10 mg/ml) untuk memastikan tidak ada gumpalan jaringan di sampel tanah. Gumpalan jaringan sulit untuk dilisiskan dan dapat mengurangi hasil DNA. Jangan campur buffer reagen A dan RNase Asebelum digunakan.
4. Inkubasi pada suhu 65°C selama 20-30 menit, balikkan dengan lembut 2-3 waktu. Langkah ini untuk lisis sel.
5. Sentrifugasi lisat untuk 5 menit pada 14,000 rpm (20,000×g).

(Catatan: Beberapa bahan tanaman mungkin mengandung banyak zat lengket pada tahap ini, yang dapat memotong DNA pada langkah selanjutnya. Idealnya, menghilangkan zat-zat ini dengan memindahkan supernatan ke tabung sentrifugasi baru setelah sentrifugasi.)

6. Pindahkan dengan hati-hati cairan yang diperoleh pada langkah sebelumnya ke tabung centrifuge baru.

(Catatan: Sekitar 500 μl cairan dapat ditransfer; untuk beberapa spesies, mungkin kurang dari 500 μl.)

7. Tambahkan kloroform dengan volume yang sama ke dalam lisat dan balikkan perlahan agar tercampur.

(Catatan: Misalnya, menambahkan 500 μl kloroform jika ada 500 μl lisat. Jika volume lisat kurang dari 500 μl, sesuaikan volume kloroform.)

8. Sentrifugasi di 12,000 rpm untuk 10 menit.
9. Pindahkan supernatan dengan hati-hati ke dalam tabung sentrifugasi baru (sekitar 500 μl).
10. Tambahkan volume yang sama buffer reagenC dan volume etanol anhidrat yang sama dengan lisat, dan campur.

(Misalnya, jika Anda menambahkan 450 μl buffer reagen C, lalu tambahkan 450 μl etanol anhidrat. Jika volume lisat kurang dari 450 μl, kurangi jumlah buffer reagen C secara proporsional. Beberapa pengendapan akan terjadi setelah penambahan buffer reagen C, tapi itu tidak akan mempengaruhi percobaan selanjutnya.)

11. Pindahkan cairan yang diperoleh ke kolom pemurnian DNA (perlengkapan), sekitar 650-700 μl setiap kali. Sentrifugasi selesai 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang sampah yang dikumpulkan, dan masukkan kembali tabung pengumpul ke dalam kolom pemurnian untuk langkah selanjutnya.
12. Ulangi langkah 11, menambahkan sisa cairan ke kolom pemurnian DNA (perlengkapan) dan sentrifugasi di atas 8,000 rpm untuk 1 menit. Buang sampah dan tabung pengumpul.
13. Tempatkan kolom pemurnian DNA (perlengkapan) ke dalam tabung koleksi baru, menambahkan 300 μl dari Mencuci Penyangga 1, centrifuge di atas 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang limbahnya, dan masukkan kembali kolom pemurnian DNA (perlengkapan) ke dalam tabung untuk langkah selanjutnya.

(Catatan: Pastikan etanol anhidrat telah ditambahkan Mencuci Penyangga 1.)

14. Menambahkan 500 μl Bilas Buffer 1 ke kolom pemurnian DNA (perlengkapan), sentrifugasi di 14,000 rpm (20,000×g) untuk 2 menit, sedikit memperpanjang waktu sentrifugasi untuk membran yang lebih kering.
15. Tempatkan kolom pemurnian DNA (perlengkapan) ke dalam tabung centrifuge yang baru, membuka, dan panaskan pada suhu 65°C selama 2 menit. Langkah ini dapat diperpanjang untuk menguapkan etanol sebanyak mungkin guna mencegah sisa etanol mempengaruhi eksperimen hilir.
16. Menetes 100 μl buffer elusike membran, sentrifugasi di 12,000 rpm untuk 2 menit.

(Catatan: 1. Mengelusi DNA dengan 50 μl buffer elusi dapat meningkatkan konsentrasi DNA tetapi menurunkan hasil DNA total. 2. Eluat dapat diaplikasikan kembali ke kolom pemurnian DNA untuk elusi kedua, sentrifugasi di 12,000 rpm untuk 2 menit untuk dikumpulkan, yang dapat meningkatkan hasil DNA.)