1. Komponen kit reagen
| Spesifikasi | 50T | 100T |
| Kucing. TIDAK. | SN0237 | SN0238 |
| Kolom Ekstraksi DNA (mengatur) | 50 (mengatur) | 100 (mengatur) |
| Penyangga Reagen E1 | 50ml | 2x50ml |
| Penyangga Reagen E2 | 30ml | 2x30ml |
| Penyangga Reagen B | 20ml | 2x20ml |
| Buffer Reagen C | 30 ml | 30 ml |
| Cuci Buffer 1 | 15 ml | 2 × 15 ml |
| Penyangga Elusi | 20 ml | 20 ml |
| Proteinase K | 1ml | 1ml |
| RNase A | 1ml | 1ml |
| Instruksi manual | 1 | 1 |
2. Penyimpanan
Kit ini dapat disimpan pada suhu kamar (15-25℃) dalam kondisi kering untuk 12 bulan. Kolom pemurnian ekstraksi DNA dapat disimpan di lingkungan sejuk dan kering 1 tahun. Proteinase K dan RNase A mengandung bahan pengawet, memungkinkan transportasi pada suhu kamar, tapi untuk penyimpanan jangka panjang, mereka harus disimpan pada -20℃. Buffer reagen E1/E2 harus disimpan pada suhu 4℃.
3. Petunjuk Penggunaan Kit Reagen
3.1 Kit reagen ini ditujukan untuk penelitian biologi molekuler dan tidak boleh digunakan untuk diagnosis atau pengobatan penyakit.
3.2 Beberapa komponen dalam kit reagen mengandung bahan iritan. Tindakan perlindungan seperti mengenakan pakaian pelindung dan kacamata direkomendasikan.
3.3 Selama penggunaan kit reagen ini, mesin sentrifugal berkecepatan tinggi, mandi air (mandi logam), pencampur pusaran, etanol anhidrat, PBS,air deionisasi steril, dan tabung EP perlu disiapkan oleh pengguna.
4. Pengantar Kit Reagen
Genom Mitokondria Pemurnian DNA Kit menawarkan metode yang cepat dan efisien untuk memurnikan DNA dari jaringan hewan dan kultur sel. Banyak digunakan dalam jaringan hewan dan kultur sel, kit ini terdiri dari dua bagian. Bagian pertama melibatkan pengumpulan cepat jaringan hewan dan mitokondria sel dengan kemurnian tinggi menggunakan sentrifugasi gradien. Bagian kedua menggunakan metode berbasis kolom untuk ekstraksi cepat DNA mitokondria tanpa memerlukan reagen beracun seperti fenol-kloroform.. DNA yang diekstraksi dapat langsung digunakan untuk PCR, Blot Selatan, dan aplikasi lainnya.
5. Prinsip dan Prosedur Eksperimental
6. Proses Ekstraksi
Sebelum Memulai Eksperimen:
A. Buffer Reagen B dan C cenderung mengendap pada kondisi suhu rendah. Disarankan untuk memanaskannya pada suhu 65°C 5 menit sampai endapan larut sebelum penggunaan normal.
B. Sebelum menggunakan Cuci Buffer 1, ikuti petunjuk pada label botol reagen untuk menambahkan etanol absolut dalam jumlah yang ditentukan. Kemudian, periksa label untuk menunjukkan bahwa etanol telah ditambahkan.
C. Buffer Elusi adalah a 0.1x solusi TE dengan konten EDTA minimal. Jika EDTA mempengaruhi percobaan selanjutnya, disarankan untuk menggunakan air deionisasi steril sebagai pengganti buffer elusi.
D. Koleksi Mitokondria: Bagian pertama melibatkan pengumpulan mitokondria, dimana sentrifugasi sangat penting. Selama proses ekstraksi, gaya sentrifugal dinyatakan dalam 'g'. Kebanyakan sentrifugal memiliki mode konversi rpm/g, jadi harap diperhatikan.
- Pemrosesan Sampel:
A. Ambil media kultur sel, centrifuge pada 1000g untuk 1 menit untuk mengumpulkan sel. Cobalah untuk menghilangkan supernatan sebanyak mungkin. Menambahkan 1ml PBS (PH7.9) untuk mencuci sel, centrifuge untuk mengumpulkannya, lalu tambahkan 1ml didinginkan terlebih dahulu (0℃) Penyangga Reagen E1 untuk sepenuhnya menangguhkan sel dan menghomogenisasi dengan cepat 5-10 waktu.
B. Potong tisu jangan melebihi 200 mg menjadi potongan-potongan kecil, menambahkan 1ml PBS (PH7.9) untuk mencuci dan menyerap kelebihan cairan dengan kertas saring. Menambahkan 1ml didinginkan terlebih dahulu (0℃) Penyangga Reagen E1 dan giling dalam penangas es 20 waktu.
2. Pindahkan campuran cairan ke dalam tabung centrifuge, sentrifugasi di 4℃, 1000g untuk 5 menit, dan pindahkan supernatan ke tabung sentrifugasi baru.
(Catatan: Mungkin terdapat endapan pada supernatan yang dipindahkan ini. Untuk mendapatkan mitokondria dengan kemurnian tinggi, dianjurkan untuk melakukan sentrifugasi dan memindahkan supernatan selama langkah 2.)
- Pindahkan supernatan yang diperoleh pada langkah sebelumnya ke tabung sentrifugasi baru, sentrifugasi pada 12000g, 4℃ untuk 10 menit, dan buang supernatannya.
(Catatan: Setelah langkah ini, mitokondria akan mengendap di dasar tabung.)
- Langkah yang disarankan: Menambahkan 5ml Reagen Buffer E2 ke pelet mitokondria, menangguhkannya kembali, sentrifugasi di 4℃, 1000g untuk 5 menit, pindahkan supernatan ke tabung centrifuge baru, kemudian disentrifugasi pada 12000g, 4℃ untuk 10 menit, buang supernatannya, dan dapatkan endapan mitokondria dengan kemurnian tinggi di dasar tabung.
(Catatan: Pengumpulan mitokondria pada langkah ini selesai. Anda dapat menghentikan percobaan dan menyimpan mitokondria di -70℃.)
Bagian kedua: Isolasi dan Pemurnian DNA Mitokondria
- Menambahkan 280μl Reagen Buffer B, 10μl RNase A, dan 10μl Proteinase K ke tabung centrifuge yang berisi mitokondria. Balikkan seluruhnya agar tercampur, mencerna di 65℃ untuk 5 menit.
- Menambahkan 300μl Reagen Buffer C ke lisat dan aduk rata. Jika muncul endapan putih, itu bisa dibiarkan tanpa gangguan; hilangnyanya tidak akan mempengaruhi eksperimen selanjutnya.
- Menambahkan 300μl etanol absolut dan aduk rata. Hal ini dapat menyebabkan curah hujan, namun hal ini tidak akan memengaruhi eksperimen selanjutnya.
- Pindahkan cairan yang diperoleh ke kolom pemurnian ekstraksi DNA (mengatur) (sekitar 650~700μl setiap kali). Centrifuge lebih dari 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang sampah yang dikumpulkan, dan masukkan kembali tabung pengumpul ke dalam kolom pemurnian untuk langkah selanjutnya.
- Tempatkan kolom pemurnian ekstraksi DNA (mengatur) ke dalam tabung koleksi, menambahkan 300μl Buffer Cuci 1, centrifuge lebih dari 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang limbahnya, dan masukkan kembali kolom pemurnian ekstraksi DNA (mengatur) ke dalam tabung untuk langkah selanjutnya.
(Catatan: Konfirmasikan bahwa etanol absolut telah ditambahkan ke Wash Buffer 1.)
- Menambahkan 400μl Buffer Cuci 1 ke kolom pemurnian ekstraksi DNA (mengatur), sentrifugasi di 14,000 rpm (20,000×g) untuk 2 menit. Perpanjang waktu sentrifugasi dengan tepat untuk membran yang lebih kering.
- Tempatkan kolom pemurnian ekstraksi DNA (mengatur) dalam tabung sentrifugasi yang baru, buka tutupnya, dan inkubasi pada 65℃ untuk 2 menit. Perpanjang langkah ini sesuai kebutuhan untuk menguapkan etanol sepenuhnya guna mencegah sisa etanol memengaruhi eksperimen hilir.
- Penangguhan tetes 50-100μl Buffer Elusi ke membran, sentrifugasi di 12,000 rpm untuk 2 menit.
(Catatan: 1. Elusi DNA dengan 50μl Elution Buffer dapat meningkatkan konsentrasi DNA tetapi mengurangi hasil total; 2. Pencucian DNA yang dielusi dapat diterapkan kembali ke kolom pemurnian ekstraksi DNA untuk pengumpulan tambahan di 12,000 rpm untuk 2 menit untuk meningkatkan hasil DNA.)
Ulasan
Belum ada ulasan.