Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.
Attrezzatura operativa: Spettrofotometro
Gatto n: BC1190
Misurare: 50T/24S
Componenti:
| Reagente | Quantità | Magazzinaggio | Preparazione |
|---|---|---|---|
| Estrarre la soluzione | 30 ml× 1 | 4°C | – |
| Reagente I | Polvere × 2 | 4°C | Aggiungere 3.3 mL di diluente da sciogliere quando utilizzato. |
| Reagente II | 10 μL× 1 | 4°C | Diluire con 2 μL di Reagente II e 10 ml di acqua distillata prima dell'uso. |
| Reagente III | 60 ml× 1 | 4°C | Sciogliere il fondo cristallizzato a bagnomaria a 50°C. Utilizzare il surnatante se il fondo rimane cristallizzato. |
| Reagente IV | 30 ml× 1 | 4°C | – |
| Reagente V | 10 ml× 1 | 4°C | – |
| Standard | Polvere × 1 | 4°C | Aggiungere 0.405 ml di acqua distillata a 10 mg di glutatione ridotto (GSH) quando utilizzato. |
| Diluente | 20 ml× 1 | 4°C | – |
Descrizione del prodotto:
- Glutatione perossidasi (GPX), noto anche come GSH-Px o GPX, è un enzima cruciale perossidasi ampiamente presente nel corpo.
- GPX svolge un ruolo significativo nel catalizzare la conversione del glutatione ridotto (GSH) al glutatione ossidato (GSSG) e nel ridurre il perossido di idrogeno tossico in composti idrossilici non tossici.
- L'azione enzimatica del GPX prevede l'ossidazione del GSH da parte del perossido di idrogeno, con conseguente produzione di GSSG.
- Il GSH reagisce con il DTNB per formare composti con caratteristici picchi di assorbimento a 412 nm.
- La diminuzione dell'assorbanza a 412 nm funge da indicatore dell'attività GPX.
Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti:
Spettrofotometro, bilancia, centrifuga da tavolo, 1 Cuvetta di vetro da ml, mortaio/omogeneizzatore, Tubo EP.
Procedura
IO. preparazione del campione:
Tessuto:
Rapporto di conformità Peso del tessuto (G): Estrarre la soluzione (ml)=1:5~10 (Consigliati 0,05 g di tessuto con 1 ml di soluzione di estratto), omogeneizzare in bagno di ghiaccio. Centrifugare a 5000 giri al minuto a 4 ℃ per 10 minuti, prendi il surnatante, e posizionarlo sul ghiaccio per il test (Se il surnatante non è limpido, centrifuga per 3 minuti).
Batteri o cellule
Quantità di cellule (104): Estrarre la soluzione (ml): 500~1000:1 (Aggiungere 1 ml di soluzione di estratto 5 milioni di cellule), ultrasuoni con bagno di ghiaccio per rompere le cellule(300W,3S, intervallo 7s,tempo totale 3 minuti). Centrifugato a 5000 giri al minuto a 4 ℃ per 10 minuti, prendi il surnatante e mettilo sul ghiaccio per il test (Se il surnatante non è limpido, centrifuga per 3 minuti).
Campione di siero: Rileva direttamente
II. Determinazione procedura:
- Preriscaldare lo spettrofotometro per 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 412 nm, e azzerare con acqua distillata.
- La soluzione standard di 20 μmol/mL è stato diluito a 0.25 μmol/mL con la soluzione di estrazione. La soluzione standard di 100 μL viene miscelato con 400 μL di Reagente IV, e la concentrazione della soluzione standard era 0.05 µmol/ml. La soluzione standard viene preparata quando viene utilizzata la miscela di soluzioni.
- Mescolare il 150 μL di campione con 150 μLof reagent I e posizionarlo a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Tavolo operatorio: (1.5 Provetta centrifuga da ml con i seguenti reagenti a turno).
| Nome del reagente(μL) | Provetta (T) | Tubo di controllo (C) |
| Supernatante del campione | 100 | – |
| Reagente I | 100 | 100 |
| Preriscaldare per 5 minuti a 37℃ | ||
| Reagente II | 50 | 50 |
| Reazione per 5 minuti a 37℃ | ||
| Reagente III | 1000 | 1000 |
| Miscele campione | – | 100 |
Centrifugare a 4000 giri al minuto a temperatura ambiente per 5 minuti e trasferire il surnatante in una provetta EP.
| Nome del reagente(μL) | Provetta (T) | Tubo di controllo (C) | Tubo standard (S) | Tubo nero (B) |
| Diluente | – | – | – | 500 |
| Supernatante | 500 | 500 | – | – |
| Miscele standard | – | – | 500 | – |
| Reagente IV | 500 | 500 | 500 | 500 |
| Reagente V | 125 | 125 | 125 | 125 |
Bene, mescola. Quindi posto a temperatura ambiente per 15 minuti, l'assorbanza a 412 viene misurato nm. L'assorbanza viene registrata come AT, AC, COME, e AB, rispettivamente. Calcolare ΔAT = AC – A, ΔAS=AS – AB.
III. Calcolo:
Calcolo della percentuale di inibizione Percentuale inibitoria =(UN GATTO)/(UN TAXI)×100%
Per quanto possibile, la percentuale di inibizione del campione rientra nell'intervallo di 30-70%, e più è vicino 50%, più è accurato. Se la percentuale di inibizione è inferiore a 30% o più di 70%, di solito è necessario aggiustare il dosaggio e rideterminarlo. Se la percentuale di inibizione è alta, il campione deve essere diluito adeguatamente. Se la percentuale di inibizione è bassa, il campione con una concentrazione elevata deve essere preparato nuovamente.
Calcolo dell'attività GPX
- Concentrazione proteica:
Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'ossidazione di 1 nmol di GSH al minuto nel sistema di reazione, ogni milligrammo di proteine.
GPX (U/mg prot) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(Cpr×VSV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷Cpr
- Peso del campione
Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'ossidazione di 1 nmol di GSH al minuto nel sistema di reazione, ogni grammo di campione.
GPX (Peso U/g) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(VSV÷VTV×W)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷W
- Quantità di celle
Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'ossidazione di 1 nmol di GSH al minuto nel sistema di reazione, ogni 104 cellule.
GPX(Cella U/104) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(N×VSV÷VTV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷N
- Volume liquido:
Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'ossidazione di 1 nmol di GSH al minuto nel sistema di reazione, ogni millilitro di liquido.
GPX (U/ml)=ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷VS÷T=200×ΔAT÷ΔAS.
CS: Concentrazione di miscele standard, 0.08 µmol/ml;
VEV: Volume del sistema di reazione enzimatica, 1.25ml;
Vsv: Volume del campione contenuto nelle miscele campione, 0.1 ml; VTV: Volume della soluzione di estrazione, 1 ml;
Cpr: Concentrazione proteica nel surnatante, mg/ml;
T: Tempo di reazione, 5 minuti;
N: La quantità di cellule, decine di migliaia; W: Peso del campione, G;
1000: 1 μmol=1000 nmol.
Nota:
- Quando l'assorbanza è maggiore di 1.2, si suggerisce di dosare il campione dopo averlo diluito con l'estrazione
- Si consiglia di non prelevare troppi campioni alla volta, per evitare l'influenza di tempi di prova troppo lunghi sullo sviluppo del colore, che potrebbe lasciare che la determinazione non lo sia
Istanze sperimentali：
- Prendi 0,1 g di fegato di topo, aggiungere 1 ml di soluzione di estratto, omogeneizzare, e macinare. Prendi il surnatante, diluirlo di 40 volte, e testare secondo le misurazioni Calcolare AT=0,108, CA=0,303, AS=0,491AB=0,033, ∆AT=AC-AT=0,195 ∆AS= AS-AB=0,458, calcolare l'attività enzimatica in base al peso del campione:
GPX (Peso U/g)=200×ΔAT÷ΔAS÷W×40（rapporto di diluizione）=34061 U/g.
- Prendi 1 g di foglia di pioppo, aggiungere 1 ml di soluzione di estratto, omogeneizzare, e macinare. Calcola AT=0,220, CA=0,318, AS=0,491, AB=0,033, ∆AT=AC-AT=0,098, ∆AS=AB-AB=0,458, calcolare l'attività enzimatica in base al peso del campione:
GPX (Peso U/g)=200×ΔAT÷ΔAS÷W=428 U/g.
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