Solarbio Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi(GAPDH) Kit di analisi dell'attività

Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi(GAPDH) Kit di analisi dell'attività

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Strumento di rilevamento: Spettrofotometro

Gatto n: BC2210

Misurare: 25T/24 ; 50T/48S

Componenti:

Estrarre la soluzione: 60 ml×1. Conservare a 4 ℃.

Reagente I: Polvere×1. Conservare a -20 ℃.

Reagente II: 50 ml×1. Conservare a 4 ℃.

Reagente III: 30 μL×1. Conservare a 4 ℃. Il liquido viene inserito nel tubo EP nel flacone del reagente. A seconda del dosaggio e del rapporto in volume del Reagente III: acqua distillata di 3:100, mescolare bene, utilizzare e preparare ora.

Descrizione del prodotto:

GAPDH (CE 1.2.1.12) catalizza l'ossidazione della gliceraldeide 3-fosfato a 1,3-difosfogliceride. È l'enzima chiave della via della glicolisi. È strettamente correlato al percorso della gluconeogenesi, il mantenimento della concentrazione di glucosio nel sangue e l’insorgenza del diabete. Svolge un ruolo importante nei disturbi del glucosio, metabolismo dei lipidi e delle proteine.

3-la fosfoglicerato chinasi può catalizzare la produzione di 1,3-difosfogliceride da trifosfato e ATP. GAPDH catalizza inversamente la formazione di gliceraldeide-3-fosfato, fosforo inorganico e NAD+ da 1,3-difosfogliceride e NADH. La diminuzione del NADH misurata a 340 nm può riflettere l'attività di GAPDH.

Materiale richiesto

Centrifuga da tavolo, spettrofotometro ultravioletto, bagnomaria a temperatura costante, mortaio/omogeneizzatore, 1 Cuvetta in quarzo da ml, trasferente, ghiaccio e acqua distillata.

Procedura:

IO. Campione Estrazione:

1. Campione di tessuto:

Secondo la massa del tessuto (G): il volume della soluzione di estrazione (ml) È 1: 5~10. Suggerito 0.1 g di tessuto con 1 ml di soluzione di estratto. Macinare completamente sul ghiaccio, centrifugare a 8000 ge 4℃ per 20 min. Il surnatante viene posto sul ghiaccio per il test.

2. Batteri o cellule:

Secondo il numero di celle (104): il volume della soluzione di estrazione (ml) È 500 ~ 1000: 1. Consiglia 5 milioni con 1 mL di soluzione di estrazione. Utilizzare gli ultrasuoni per dividere batteri o cellule (energia 20% o 200 W, tempo di lavoro 3 secondi, intervallo 10s, ripetere per 30 volte). Centrifugare a, 8000 ge 4℃ per 10 min. Il surnatante viene posto sul ghiaccio per il test.

3. Siero (plasma): misurazione diretta.

II. Determinazione procedura:

• Preriscaldare lo spettrofotometro ultravioletto 30 min, regolare la lunghezza d'onda su 340 nm, azzerare con acqua distillata.
• Preparazione della soluzione di lavoro: versare tutto il Reagente II in una bottiglia di Reagente I. Completamente dissolto. Preriscaldare una certa quantità di 37 ℃ (mammifero) o 25 ℃ (altre specie) per 10 min come richiesto. I reagenti non utilizzati devono essere conservati a — 20℃ dopo la ricarica secondaria. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.
• Aggiungere i reagenti con il seguente elenco:

III. Calcolo:

Calcolato mediante microcuvetta al quarzo

• Calcolato dalla concentrazione proteica:

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzimi consumati 1 nmol di NADH nel sistema di reazione al minuto, ogni mg di proteine.

Attività GAPDH (U/mg prot) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×Cpr)÷T=1072×ΔA÷Cpr

• Calcolato in base al peso del campione

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzimi consumati 1 nmol di NADH nel sistema di reazione al minuto, ogni g di campione.

Attività GAPDH (U/g peso fresco) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×W÷VST)÷T= 1072×ΔA÷W

• Calcolato in base ai batteri o alla quantità di cellule:

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzimi consumati 1 nmol di NADH nel sistema di reazione al minuto, ogni 104 batteri o cellule.

Attività GAPDH (Cella U/104) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×500÷VST)÷T = 2,14×ΔA

• Calcolato in base al volume del terreno di coltura:

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzimi consumati 1 nmol di NADH nel sistema di reazione al minuto, ogni ml di liquido.

Attività GAPDH (U/ml) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷VS÷T= 1072×ΔA

e: coefficiente di estinzione molare del NADH: 6.22×103 L/mol/cm; D: percorso luminoso della cuvetta, 1 cm;

la corda: volume totale di reazione, 0.001 l;

VS: volume del campione nel sistema di reazione, 0.03 ml; VST: volume della soluzione di estrazione aggiunto, 1 ml; Cpr: concentrazione delle proteine ​​del campione, mg/ml;

W, massa del campione, G;

T: tempo di reazione, 5 min;

109: fattore di conversione, 1 moli = 109 nmol;

500: Numero di celle, 5 milioni.

Nota:

1. Quando A1 è inferiore a 0.8 oppure ΔA è maggiore di 0.7, si consiglia di diluire il campione prima della determinazione.
2. La provetta vuota è una provetta per testare la qualità di ciascun componente del reagente. In condizioni normali, la variazione non supera 01.

Esempio sperimentale:

1. Prendi 0,1 g di rene di coniglio, aggiungere 1 ml di soluzione di estratto, omogeneizzare in un bagno di ghiaccio, poi centrifugare a 8000g, 4℃ per 20 min, prendi il surnatante e mettilo in ghiaccio, quindi operare con microcuvetta di quarzo secondo le fasi di determinazione, misurare e calcolare: ΔAT=A1T-A2T =0,815-0,158=0,657, ΔAB=A1B – A2B=0,865-0,864=0,001, ΔA = ΔAT – ΔAB = 656.

Attività GAPDH (Massa U/g) = 1072×ΔA ÷ W = 7032.32 Massa U/g.

2. Prendi 0,1 g di trifoglio, aggiungere 1 ml di soluzione di estratto, omogeneizzarlo in un bagno di ghiaccio, quindi centrifugarlo a 8000 g e 4 ℃ per 20 min, prendi il surnatante e mettilo in ghiaccio, quindi operare secondo le fasi di determinazione, misurarlo e calcolarlo con una micro cuvetta al quarzo, ΔAT = A1T – A2T=1,026-1,017=0,009, ΔAB=A1B – A2B=0,865-0,864=0,001, ΔA = ΔAT – ΔAB=008.

Attività GAPDH (Massa U/g) = 1072 × ΔA ÷ W =85,76 U/g massa.

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