注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを採取します.
操作装置: 分光光度計
カタログ番号: BC1190
サイズ: 50T/24S
コンポーネント:
| 試薬 | 額 | ストレージ | 準備 |
|---|---|---|---|
| 抽出液 | 30 mL× 1 | 4℃ | – |
| 試薬I | パウダー× 2 | 4℃ | 追加 3.3 使用時に溶解する希釈剤のmL. |
| 試薬II | 10 μL× 1 | 4℃ | で希釈します 2 μL 試薬 II および 10 使用前に蒸留水 mL. |
| 試薬Ⅲ | 60 mL× 1 | 4℃ | 結晶化した底部を50℃のウォーターバスで溶解します。. 底部が結晶化したままの場合は上清を使用してください. |
| 試薬IV | 30 mL× 1 | 4℃ | – |
| 試薬V | 10 mL× 1 | 4℃ | – |
| 標準 | パウダー× 1 | 4℃ | 追加 0.405 蒸留水 mL ～ 10 還元型グルタチオン mg (GSH) 使用時. |
| 希釈剤 | 20 mL× 1 | 4℃ | – |
製品説明:
- グルタチオンペルオキシダーゼ (GPX), GSH-Px または GPX とも呼ばれます, 体内に広く存在する重要なペルオキシダーゼ酵素です.
- GPX は還元型グルタチオンの変換を触媒する際に重要な役割を果たします (GSH) 酸化されたグルタチオンに (GSSG) 有毒な過酸化水素を無毒なヒドロキシル化合物に還元する.
- GPX の酵素作用には、過酸化水素による GSH の酸化が含まれます。, GSSG が生成される.
- GSH は DTNB と反応して、特徴的な吸収ピークを持つ化合物を形成します。 412 nm.
- での吸光度の減少 412 nm は GPX 活動の指標として機能します.
必要だが提供されていない試薬と装置:
分光光度計, バランス, 卓上遠心分離機, 1 mLガラスキュベット, モルタル/ホモジナイザー, EP管.
手順
私. サンプルの準備:
組織:
一致率 組織重量 (g): 抽出液 (mL)=1:5~10 (推奨される組織 0.05g と 1mL の抽出液), 氷浴上でホモジネートする. で遠心分離します。 5000 4℃での回転数 10 分, 上清を取る, テストのために氷の上に置きます (上清が透明でない場合, 遠心分離機用 3 分).
細菌とか細胞とか
細胞の量 (104): 抽出液 (mL): 500~1000:1 (抽出液1mLを加えます。 5 百万個の細胞), 細胞を破壊するための氷浴を使用した超音波(300W,3s, インターバル7秒,合計時間 3 分). で遠心分離 5000 4℃での回転数 10 分, 上清を採取し、試験のために氷上に置きます (上清が透明でない場合, 遠心分離機用 3 分).
血清サンプル: 直接検出
Ⅱ. 決定 手順:
- 分光光度計を予熱します。 30 分, 波長を調整して 412 nm, 蒸留水でゼロに設定します.
- の標準溶液 20 μmol/mL に希釈しました 0.25 μmol/mL（抽出液あり）. の標準溶液 100 μLを混合する 400 試薬 IV μL, 標準溶液の濃度は 0.05 μmol/mL. 標準溶液は混合溶液を使用する場合に調製されます。.
- 混ぜ合わせます 150 サンプルのμL 150 試薬 I を μL 加え、室温に放置します。 5 分.
- 操作テーブル: (1.5 mL 遠心管に次の試薬を順番に入れます).
| 試薬名(μL) | 試験管 (T) | コントロールチューブ (C) |
| サンプル上清 | 100 | – |
| 試薬I | 100 | 100 |
| 予熱 5 37℃で3分 | ||
| 試薬II | 50 | 50 |
| に対する反応 5 37℃で3分 | ||
| 試薬Ⅲ | 1000 | 1000 |
| サンプル混合物 | – | 100 |
で遠心分離します。 4000 室温でのrpm 5 数分後、上清をEPチューブに移します。.
| 試薬名(μL) | 試験管 (T) | コントロールチューブ (C) | 標準チューブ (S) | 黒いチューブ (B) |
| 希釈剤 | – | – | – | 500 |
| 上清 | 500 | 500 | – | – |
| 標準混合物 | – | – | 500 | – |
| 試薬IV | 500 | 500 | 500 | 500 |
| 試薬V | 125 | 125 | 125 | 125 |
よく混ぜます. その後、室温に置きます 15 分, での吸光度 412 nmを測定します. 吸光度はATとして記録されます。, 交流, として, とAB, それぞれ. ΔAT = ACの計算 – で, ΔAS= AS – AB.
Ⅲ. 計算:
阻害率の計算 阻害率 =(猫)/(タクシー)×100%
可能な限り, サンプルの阻害率は以下の範囲内です。 30-70%, そしてそれに近づくほど 50%, より正確であるほど. 阻害率が以下の場合 30% またはそれ以上 70%, 通常、投与量を調整して再決定する必要があります. 抑制率が高い場合, サンプルは適切に希釈する必要があります. 抑制率が低い場合, 高濃度のサンプルは再度調製する必要があります.
GPX活動量の計算
- タンパク質濃度:
単位の定義: 酵素活性の1単位は、反応系内で1分間に1nmolのGSHの酸化を触媒する酵素の量として定義されます。, タンパク質のすべてのミリグラム.
GPX (U/mgプロット) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(CPR×VSV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷Cpr
- サンプル重量
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、酸化を触媒する酵素の量として定義されます。 1 反応系内の 1 分あたりの GSH の nmol, サンプル1グラムごとに.
GPX (U/g重量) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(VSV÷VTV×W)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷W
- 細胞量
単位の定義: 酵素活性の1単位は、反応系内で1分間に1nmolのGSHの酸化を触媒する酵素の量として定義されます。, 毎 104 細胞.
GPX(U/104セル) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(N×VSV÷VTV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷N
- 液量:
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、酸化を触媒する酵素の量として定義されます。 1 反応系内の 1 分あたりの GSH の nmol, 液体1ミリリットルごとに.
GPX (U/mL)=ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷VS÷T=200×ΔAT÷ΔAS.
CS: 標準混合物の濃度, 0.08 μmol/mL;
VEV: 酵素反応系の体積, 1.25mL;
VSv: サンプル混合物に含まれるサンプル量, 0.1 mL; VTV: 抽出液量, 1 mL;
心肺蘇生法: 上清タンパク質濃度, mg/mL;
T: 反応時間, 5 分;
N: 細胞の量, 何万もの; W: サンプル重量, g;
1000: 1 μmol=1000nmol.
注記:
- 吸光度がそれより大きい場合 1.2, 抽出液で希釈した後にサンプルを測定することをお勧めします。
- 一度にあまり多くのサンプルを採取しないことをお勧めします, 発色に対する長すぎるテスト時間の影響を避けるため, 判断ができない可能性があります
実験用インスタンス：
- マウスの肝臓を0.1g採取する, 抽出液1mLを加える, ホモジネート, そして粉砕します. 上清を採取する, それを薄める 40 回, 測定結果に従ってテストし、AT=0.108 を計算します。, AC=0.303, AS=0.491AB=0.033、ΔAT=AC-AT=0.195 ΔAS=AS-AB=0.458, サンプル重量に応じて酵素活性を計算します:
GPX (U/g重量)=200×ΔAT÷ΔAS÷W×40（希釈倍率）=34061U/g.
- ポプラの葉を1g取ります, 抽出液1mLを加える, ホモジネート, そして粉砕します. AT=0.220を計算, AC=0.318, AS=0.491, AB=0.033, ΔAT=AC-AT=0.098、ΔAS=AB-AB=0.458, サンプル重量に応じて酵素活性を計算します:
GPX (U/g重量)=200×ΔAT÷ΔAS÷W=428U/g.
レビュー
まだレビューはありません.