ソーラーバイオヒドロキシプロリン (HYP) 活性アッセイキット

ヒドロキシプロリン (HYP) 活性アッセイキット

注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.

検出装置: 分光光度計/マイクロプレートリーダー

カタログ番号: BC0255

サイズ: 100T/96S

コンポーネント:

抽出液: 6 mol/L塩酸 (塩酸), 自前試薬. 濃塩酸（37%） : H2O(V/V) =1:1, 室温で保管.

試薬I: 8 mL×1, 遮光して4℃で保存してください. 試薬II: 8 mL×1, 遮光して4℃で保存してください. 標準: 0.5 mL×1, 0.5 mg/mL ヒドロキシプロリン, 4℃で保存.

説明:

HYPは体内のコラーゲンの主要成分の1つです. コラーゲンのほとんどは皮膚に分布しています, 腱, 軟骨, 血管など. したがって, HYPの含有量はコラーゲン組織の代謝や線維化の程度を反映する重要な指標です.

サンプルは加水分解されて遊離 HYP が生成されます。, これはクロラミン T によってさらに酸化されます。. 酸化生成物は p-ジメチルアミノベンズアルデヒドと反応して、特徴的な吸収ピークを持つ赤色の化合物を生成しました。 560 nm. HYPの含有量は、サンプル加水分解物の吸収値を測定することで計算できます。 560 nm.

必須だが提供されていない:

天秤, オーブン, ガラスのチューブ, 遠心, 水浴, 分光光度計/マイクロプレートリーダー, マイクロガラスキュベット/96ウェルプレート, 6 mol/L HClと蒸留水.

手順:

私. サンプルの準備

1. 1. 組織サンプル:

およその重さを量る 0.2 サンプルをガラス管に入れます（g）, 消化のために組織をできるだけ細かく切る. 追加 2 抽出液 mL、カバーがわずかに緩んでいて気密性が低い, 茹でるか110℃のオーブンで焼いてください。 2 に 6 目に見える大きな塊がなくなるまで何時間もかけて消化する.

冷却後, pHを調整する 6-8 と 10 mol/L NaOH (酸性やアルカリ性を高めすぎないでください) 次に一定の音量に 4 蒸留水で mL. 遠心分離 16000 の回転数 20 25℃で1分 (遠心分離後も不純物が残っている場合, 濾過によって除去することができます).

検査のために上清を採取します. (製造過程で黒い物質が発生する場合があります, そして、長期間消化できない場合は、, 炭化物かもしれない. 実験には影響ありません).

2. 細胞:

取る 5 百万個の細胞, 追加 1 抽出液 mL, 沸騰させる, または110℃のオーブンで 2 に 6 透明な状態まで消化するのに何時間もかかる.

冷却後, pHを調整する 6-8 と 10 mol/L NaOH (酸性やアルカリ性を高めすぎないでください) 次に一定の音量に 2 蒸留水で mL. 遠心分離 16000 の回転数 20 25℃で1分 (遠心分離後も不純物が残っている場合, 濾過によって除去することができます).

検査のために上清を採取します.

Ⅱ. 検出

1. 予熱分光光度計/マイクロプレートリーダー 30 分, 波長を調整して 560 nm を蒸留してゼロに設定します
2. 標準液を次のように希釈します。 30, 15, 7.5, 3.75, 1.875, 0.938, 0.469, 0.234 μg/mL.
3. 次の表のように試薬を追加します.

よく混ぜます, 60℃でインキュベートする 20 分, 室温でしばらく放置します 15 分, 反応液 200μL をマイクロガラスキュベット/96 ウェル平底プレートに採取し、at での吸光度を測定します。 560 nm. ΔA = AT – AB.

Ⅲ. 計算

1. 規格づくり

検量線作成時, 標準溶液の濃度を横軸にとります。, そしてΔAS (ΔAS =AS-AB) y 軸とみなされます. 一次方程式 y=kx+b が得られます。. ΔATを取る (AT-AB) xを求める方程式に代入する.

2. ヒドロキシプロリン含有量の計算:サンプルの新鮮重量に基づいて計算されます:

組織ヒドロキシプロリン含有量 (μg/生体重g) = x×VS÷(W×VS÷VTE) = 4x​​÷W.

• サンプルタンパク質濃度に応じて計算:

組織ヒドロキシプロリン含有量 (μg/mgプロット) = x×VS÷(CPR×VS) = x÷Cpr.

• 細菌または細胞の数に応じて計算されます:

細胞のヒドロキシプロリン含有量 (μg/104 細胞) = x×VS÷(N×VS÷VCE )= 2x÷N.

VS: 添加サンプル量, 0.06 mL;

VTE: 組織抽出液の量, 4 mL; VCE: 細胞抽出液の量, 2 mL;

W: サンプルの生重量, g;

N: セルの数,104 単位として, 10000;

心肺蘇生法: サンプルタンパク質の濃度, mg/mL.

注記

1. OD 値が より大きい場合 1.0, サンプルは適切に希釈してから測定する必要があります. 計算式における希釈倍数の乗算に注意.
2. 試薬には一定の毒性があります. 吸入や皮膚への接触を防ぐため、操作中は保護措置を講じてください。.
3. サンプルタンパク質濃度に応じて計算する場合, サンプル自体のタンパク質を個別に抽出して測定する必要がある.

実験例

• 0.2サンプル処理のためにマウスの足のグラムを採取します, 上清を取り出し、測定手順に従って操作します。. ΔA =AT-AB = 0.177-0.06 = 0.117 によって測定されます 96 ウェルプレート, 標準曲線 y = 0.0383x + 0.022 持ち込まれる, そしてx = 2.48 は

組織中のヒドロキシプロリンの含有量 (μg/g質量) = 4x​​ ÷ W = 4 × 2.48 ÷ 0.2 = 49.6 μg/g質量.

最近の製品の引用

• リートンファン,チェン・ジアチン,タオ・ヤンメン,他. グレリンによる間葉系幹細胞の軟骨形成分化の促進と軟骨修復. 整形外科研究ジャーナル. 1月 2019;(IF3.043)

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技術仕様:

検出限界: 0.057 μg/mL

線形範囲: 0.117-30 μg/mL