コハク酸デヒドロゲナーゼ (SDH) 活性アッセイキット
注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.
検出装置: 分光光度計
カタログ番号: BC0950
サイズ: 50T/48S
コンポーネント
試薬I: 60 mL×1, -20℃で保存. 試薬II: 0.6 mL×1, -20℃で保存. 試薬Ⅲ: 5 mL×1, 4℃で保存.
試薬IV: パウダー×1, 4℃で保存. ソリューションがいつ使用されるか, 試薬 III に加えて溶解して使用します。.
試薬V: パウダー×1, 4℃で保存. 追加 4 溶液を使用する場合は蒸留水 mL, 未使用の試薬は4℃で保管されます.
試薬VI: パウダー×1, -20℃で保存. 追加 3.333 溶液を使用する場合は蒸留水 mL, 未使用の試薬は4℃で保管されます.
説明
コハク酸デヒドロゲナーゼ (SDH, EC 1.3.5.1) 動物に広く見られる, 植物, 微生物と培養細胞. SDHはミトコンドリアのマーカー酵素です, ミトコンドリアの内膜に存在する膜結合酵素です。. これは、呼吸電子伝達と酸化的リン酸化の重要なポイントの 1 つでもあります。. 加えて, さまざまな原核細胞の呼吸鎖に電子を提供します。.
SDH はコハク酸からフマル酸への脱水素反応を触媒できます。. 脱水素反応により、2,6-ジクロロフェノール、インドフェノールが減少します。 (DCPIP) フェナジンジメチル硫酸の移送下 (PMS). 2,6- DCPIP には特徴的な吸収ピークがあります。 600 nm. 2,6-DCPIP の還元率は、2,6-DCPIP における吸光度の変化によって決まります。 600 nm, SDH酵素の活性を表す.
必須だが提供されていない
分光光度計, 水浴, 卓上遠心機, 調整可能なピペット, モルタル/ホモジナイザー, 1 mLガラスキュベット, 氷と蒸留水.
プロトコル
私. SDHの抽出:
正確に計量する 0.1 組織グラムまたは収集 5 百万個の細胞, 追加 1 試薬 I mL と 10 試薬 II μL, 氷浴中でホモジナイザー/乳鉢を使用して均質化する, 完全に粉砕する, で遠心分離する 11000 ×gの場合 10 4℃で5分, 上清を採取し、試験のために氷上に置きます.
Ⅱ. 手順
- 予熱用分光光度計 30 分, 波長を調整して 600 nm を測定し、蒸留水でゼロに設定します.
- 手順テスト
| 試薬名 (μL) | 試験管 (T) | 黒いチューブ (B) |
| 試薬Ⅲ | 60 | 60 |
| 試薬V | 60 | 60 |
| 蒸留水 | 800 | 800 |
| 25℃で保温してください(一般種) または37℃(哺乳類) 水浴用 10 分. | ||
| サンプル | 30 | – |
| 蒸留水 | – | 30 |
| 試薬VI | 30 | 30 |
各試薬を追加します 1 mL ガラスキュベットを順に, 試薬 VI の追加と同時に計測を開始します, の波長での初期吸光度 A1 を記録します。 600 nmの 20 秒. キュベットを反応液ごと37℃のウォーターバスに入れます。 (哺乳類) または25℃ (他の種), そして正確な反応 1 分. キュベットを素早く取り出して乾燥させます, 吸光度 A2 を記録します。 80 秒 600 nm. ΔA = A1-A2, ΔATを求める, ΔAB.
Ⅲ. SDHの計算 活動
で判定するための計算式 1 mLガラスキュベット.
- タンパク質濃度
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、消費される酵素の量として定義されます。 1 反応系における 1 分あたりの 2,6-ジクロロフェノール インドフェノール nmol、組織タンパク質 1 mg.
SDH(U/mgプロット)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)×VRV×109]÷(CPR×VS) ÷T＝1555.556×(ΔAT-ΔAB)÷心肺蘇生法
- サンプル重量
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、消費される酵素の量として定義されます。 1 反応系内の 1 分あたりの 2,6-ジクロロフェノール インドフェノール nmol 組織グラムごと.
SDH(U/g)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)×VRV×109]÷(VS÷VST×W) ÷T＝1571.111×(ΔAT-ΔAB)÷W
- 細菌または細胞
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、消費される酵素の量として定義されます。 1 反応系内で 1 分あたり 2,6-ジクロロフェノール インドフェノールの nmol 10 千の細菌または細胞.
SDH(U/104セル)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)×VRV×109]÷(VS÷VST×500) ÷T
＝3.142×(ΔAT-ΔAB)
VRT: 総反応量, 0.98×10-3L;
e: 2,6-DCPIPのモル吸光係数, 2.1×104L/mol/cm; d: キュベットの光径, 1 cm;
対: サンプル量, 0.03 mL;
VST: 試薬 I と試薬 II の量を追加します。, 1.01 mL; T: 反応時間(分), 1 分;
心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度, mg/mL; W: サンプル重量, g;
500: 細胞または細菌, 5 百万.
注記
- 変性や失活を避けるため、測定中はすべての試薬とサンプルを氷上に置きます。.
- ΔAがより大きい場合 0.5, 未満のΔAを得るには、酵素溶液を酵素抽出物で希釈する必要があります。 0.5, 検出感度を向上させることができます.
- 抽出液には一定濃度のタンパク質が含まれているため、 (について 1 mg/mL), サンプルのタンパク質濃度を決定する際には、抽出液自体のタンパク質含有量を差し引く必要があります。.
実験例:
- 腎臓を0.1g摂取する, 追加 1 試薬Ⅰ mL と 10 μL試薬Ⅱ, ホモジネートを氷浴で粉砕する, 4℃、11000gで遠心分離 10 分, 上清を氷上に置きます. 決定手順によると, 酵素活性は次のように計算されます。: ΔAT= A1T- A2T=0.82-0.681=0.139, ΔAB=A1B- A2B=905-0.904=0.001
SDH活動 (U/g質量) = 961.905×(ΔAT- ΔAB) ÷ W =2168.13 U/g 質量.
参考文献
- ファットレッティ P, ベルトーニ・フレダリ C, カセリ U, 他. 加齢に伴うラットプルキンエ細胞ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼ活性の低下[J]. 老化と発達のメカニズム, 1998, 101(1-2): 175- 182.
関連製品
BC0710/BC0715 α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(α-KGDH) 活性アッセイキット
BC2150/BC2155 クエン酸(カリフォルニア州) コンテンツアッセイキット
BC0380/BC0385 ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH) 活性アッセイキット
レビュー
まだレビューはありません.