고양이 번호: BC3830

크기: 50T/48S

저장： 시약은 실온에서 운반됩니다., 도착 후 필요에 따라 보관, 그리고 그 안에서는 안정적이다 0.5 연령.

제품 구성

시약Ⅰ: 20 밀리리터×1. -20℃에서 보관；

시약 Ⅱ: 60 밀리리터×1. -20℃에서 보관.

시약 Ⅲ: 0.55 밀리리터×1. -20℃에서 보관, 빛을 피하다. 5mM pNA 표준: 1 밀리리터×1. -20℃에서 보관, 빛을 피하다.

표준희석액의 제조: 가져가다 9 mL의 시약 Ⅰ을 추가하고 1 시약 Ⅱ의 mL, 잘 섞다, 그리고 사용을 기다립니다. (시약Ⅰ의 비율에 따라 조제할 수도 있다.: 시약 Ⅱ = 9:1).

제품 설명:

카스파제는 세포사멸 과정에 관여하는 프로테아제 계열입니다, 이상 포함 10 회원. Caspase-3는 세포사멸 과정에서 가장 중요한 말단 프로테아제입니다., 이는 또한 가장 많이 연구된 카스파제이기도 합니다.; pro-caspase-2,6,7,9를 활성화시킵니다., 특히 다양한 주요 세포사멸 단백질을 가수분해합니다., PARP와 같은, 염색질 응축을 매개합니다., 세포사멸체 형성, 그리고 핵 DNA 단편화.

카스파제-3 비색 분석은 펩타이드 기질 DEVD-pNA의 가수분해를 기반으로 합니다. (ASP- Glu-Val-Asp-p-니트로아닐리드) 카스파제-3에 의해, 결과적으로 p-니트로아닐린이 방출됩니다. (pNA) 절반. 피- 니트로아닐린은 흡광도가 높습니다. 405 nm. Caspase의 활성은 pNA를 검출하여 계산할 수 있습니다.. 이 키트는 포유류 조직 및 세포에 적합합니다..

필요하지만 제공되지 않는 시약 및 장비:

분광 광도계/마이크로플레이트 리더, 100μL 큐벳/96웰 플레이트, 원심분리기, 수조/인큐베이터, 조절 가능한 피펫, 모르타르/균질화기, 얼음, 그리고 증류수.

절차:

ㅏ. 샘플 준비:

1. 세포: 원심 분리기 튜브에 세포를 수집, 원심분리하고 상층액을 버린다; 세포 수에 100μL Reagent Ⅱ를 추가합니다. (~에 대한 106 세포), 침전물을 흔들어서 다시 부유시키십시오., 그런 다음 15분 동안 얼음 위에 서세요., 4℃에서 15000g 원심분리기 10 15 분, 상등액을 채취하여 얼음 위에 올려 놓으세요. (으로 증가할 수 있다 150-200 균열이 충분하지 않은 경우 μL Reagent Ⅱ)
2. 조직: 조직 질량의 비율에 따라 (g): 시약 Ⅱ량 (밀리리터) ~의 1:5-10 (무게를 측정하는 것이 좋습니다 0.1 g 티슈 추가 1 시약 Ⅱ의 mL), 얼음물에 갈거나 잘게 썰어주세요, 얼음 위에 올려 놓으세요 15 분, 4℃에서 원심분리한다 10-15 분, 상등액을 채취하여 얼음 위에 올려 놓고 테스트해 보세요..

비. 결정 절차:

1. 분광광도계/마이크로플레이트 리더를 예열합니다. 30 분, 파장을 조정하여 405 nm, 증류수를 0으로 조정합니다..
2. 사용하기 전에, 5 mmol/L PNA 표준용액을 희석하여 200, 100, 50, 25, 5, 그리고 0 표준 용액 희석제를 포함한 μmol/L 표준 용액.
3. 샘플 결정 (다음 시약을 순서대로 추가합니다. 96 우물 접시 / EP튜브)

씨. 활동 계산:

1. 표준곡선의 확립

표준관의 농도에 따라 표준방정식을 만든다. (엑스, μmol/L) 및 ΔAS (와이, 튜브 빼기 0 집중). ΔAT의 결정은 x를 얻기 위해 표준 방정식으로 대체됩니다. (μmol/L).

2. 효소 활성의 증가된 비율에 따라

카스파제-3 활성 비율 증가 = ((실험치료군 AT)- AB) / ((실험대조군 AT)- AB) × 100%

이 방법은 간단하고 신뢰할 수 있으며 효소 활성을 대략적으로 결정하는 데 사용할 수 있습니다..

3. 효소 활성으로 계산

1 단위는 절단되는 효소의 양입니다. 1.0 포화 기질 농도 하에서 37℃에서 시간당 비색 pNA 기질의 nmol. 샘플의 카스파제 활성을 계산할 수 있습니다.

카스파제-3 활성 (U/mg 프로트) = x × VR ¼ (VS × 심폐소생술 ) ¼ 티 × 103 = 2x ¼ Cpr ¼ t

VR: 반응 시스템의 총 부피, 0.1 밀리리터 = 10-4 엘; VS: 추가된 샘플의 양, 0.05 밀리리터; 티: 반응 시간, 1 시간; 심폐소생술: 샘플 단백질의 농도, mg/mL; 103: 단위 환산 계수, 1 μmol = 103 nmol.

메모:

1. 시약 I에는 환원제가 포함되어 있으므로 (DTT), 샘플을 희석하는 것이 좋습니다 2 증류수로 여러 번 처리한 후 Bradford 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정하여 단백질 농도 측정에 대한 DTT의 간섭을 줄입니다.. 단백질 측정에 BCA 방법을 사용하는 것은 권장되지 않습니다.
2. 카스파제 활성 값이 낮은 가장 일반적인 이유는 세포가 세포사멸을 겪지 않았기 때문입니다., 세포의 양이 너무 적거나 관찰 시간이 길다. 세포사멸을 유도할 때, 복용량이 많아지는 것은 아니다., 시간이 길어질수록, 카스파제 활성이 높을수록. 다음과 같이 다양한 용량과 시점을 설정하는 것이 좋습니다. 0, 2, 4, 8, 16, 그리고 24 최적의 관측 지점을 탐지하는 데 걸리는 시간.
3. 측정된 시료의 값이 표준곡선의 상한값보다 높은 경우, 시료를 Reagent Ⅱ로 희석한 후 다시 측정할 수 있습니다..
4. 96웰 플레이트를 단단히 덮고 파라필름으로 밀봉합니다.. 배양 장소 37 °C, 색상이 노란색으로 변할 때의 OD405 값은 약 0.2, 이때 측정할 수 있는 것은. 미미한 색상 변화로 인해 반응이 연장되거나 밤새 지속될 수 있습니다., 하지만 효소 활성이 강할 때는, 배양 시간이 너무 길면 반응이 선형성을 잃게 됩니다.

최근 제품 인용：

• 왕비 , 왕 K , 진 T , 외. NCK1-AS1은 신경 교종 세포 증식을 향상시킵니다, 방사선 저항, miR-22-3p/IGF1R ceRNA 경로를 통한 화학저항성[제이]. 생물의학 & 약물요법, 2020, 129:110395.
• 왕 Z , 쉬 JH , 모우제이제이 , 외. 온화한 추운 환경에서 모이는 Brandt'svoles의 심장 미토콘드리아에 대한 새로운 미세 구조 발견[제이]. 비교 생화학 및 생리학 – 파트 A 분자 & 통합생리학, 2020, 249:110766.

참고자료:

• 코헨 GM. 카스파제: 아포토시스의 집행자. 바이오켐 J, 1997, 326:1-16.
• 재니케R U, 슈프렌가르트 M L, 와티 M R, et apoptosis에서 caspase-3의 새로운 역할[제이]. 세포 사멸과 분화, 1999, 6:99-104.

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