AFLP 란 무엇입니까?? 완전한 원리와 운영 프로세스

소개

• AFLP는 제한효소에 의해 생성되는 단편의 길이를 제한하여 DNA 다형성을 검출하는 DNA 분자마커 기술입니다..
• AFLP 기술의 주요 특징은 다음과 같습니다.:
  • 분석을 위해서는 소량의 DNA가 필요합니다., 단 0.5g.
  • 좋은 재현성을 보여줍니다.
  • 강력한 다형성을 보여줍니다..
  • 고해상도 제공.
  • 남부 혼성화가 필요하지 않습니다..
  • 다양한 샘플에 적합.
  • 안정적인 유전을 나타냄.
• 기술적 특징으로는, AFLP는 RAPD와 RFLP를 결합한 제품입니다..
• RFLP 기술의 복잡성과 방사능 위험이라는 단점을 극복합니다., 두 가지 장점을 통합하면서 RAPD의 유전적 마커의 불안정성과 우세.
• 최근에는, 이 기술은 지속적으로 개선되고 발전되어 왔습니다., AFLP를 현재까지 가장 효과적인 분자 방법으로 급속하게 만들었습니다..

AFLP의 원리

• AFLP는 제한효소에 의해 생성되는 단편의 길이를 제한하여 DNA 다형성을 검출하는 DNA 분자마커 기술이기도 합니다..
• 하지만, AFLP는 효소 절단 단편을 증폭시키는 과정을 포함합니다. PCR 반응이 먼저다, 증폭된 효소 절단 단편을 고해상도 시퀀싱 젤에서 전기영동합니다.. 증폭된 단편의 다양한 길이를 기반으로 다형성이 검출됩니다..
• 실험에서는, 효소 절단 단편은 먼저 호환 가능한 응집력이 있는 말단을 포함하는 인공 어댑터에 연결됩니다.. 이러한 응집력 있는 끝의 순서, 어댑터 시퀀스와 함께, 후속 PCR 반응을 위한 결합 부위 역할을 합니다..
• 요구 사항에 따라, 서로 다른 프라이머 1 에게 3 말단에 추가된 선택적 뉴클레오티드를 사용하여 선택적 증폭을 달성할 수 있습니다.. 이러한 선택적 뉴클레오티드는 프라이머가 특정 쌍 배열 서열을 갖는 효소 절단 단편을 선택적으로 인식할 수 있게 해줍니다., 특정 증폭으로 이어지는.

테스트에 사용된 시약

실험용 시약	설명
Taq 효소	DNA 중합효소
EcoRI/MseI 어댑터	제한 효소 어댑터
E+A 프라이머	PCR 증폭용 프라이머
M+C 프라이머	PCR 증폭용 프라이머
T4 DNA 리가제	DNA 리가아제 효소
E 및 M 올리고뉴클레오티드	PCR용 올리고뉴클레오티드
아가로스	전기영동용 겔 매트릭스
과황산암모늄	겔 캐스팅 및 DNA 변성용 촉매
아크릴아미드	고해상도 시퀀싱을 위한 겔 매트릭스 구성 요소
요소	전기영동용 변성제
질산은	DNA 밴드를 시각화하기 위한 염색
포름아미드	DNA 서열 분석 젤용 변성제
dNTP	PCR용 데옥시뉴클레오티드 삼인산염
자일렌시아놀	전기영동용 추적염료
아세트산	젤 준비에 사용
유리 실란	겔전기영동용 유리판 코팅제
50bp 마커	DNA 마커 50 크기 참조용 염기쌍

실험적 절차

1. 게놈 DNA 추출 및 정제

DNA 추출 방법 참조.

DNA 정제:

• DNA 단편의 전기영동 0.8% 아가로스 젤 (0.5μg/ml 에티듐 브로마이드 함유, EB), 테이크아웃 1/3 추출된 genomic DNA를 정제용으로.
• 첫째로, 추출된 DNA의 부피를 TE 완충액으로 전체 부피로 보충합니다. 50 μl.
• 페놀/클로로포름/이소아밀알코올로 1회 추출 (25:24:1) 클로로포름/이소아밀 알코올로 한 번 (24:1). 원심분리하고 상층액을 Eppendorf 튜브로 옮김.
• 추가하다 1/10 NaAc의 부피와 사전 냉각된 무수 에탄올의 부피의 두 배, 그리고 최소한 -20°C에 두세요. 2 시간. 10,000g 원심분리기 10 분.
• DNA 침전물을 두 번 씻으십시오. 70% 에탄올, 공기 건조, 그리고 용해된다 30 μl TE 버퍼.
• UV-2401PC를 사용하여 A260 및 A280 값을 측정합니다. (시마즈) 정량용 UV 분광 광도계.
• DNA 단편의 전기영동 0.8% 아가로스 젤 (0.5μg/ml EB 함유) 크기 결정을 위해.

메모:

• 0.1-0.2g 조직의 경우, 100μl 용액 E에 용해. 0.5g 티슈용, 용액 E를 300μl로 늘립니다.. 이 지점에서, DNA 농도는 약 100ng/μl입니다..

2. 제한효소 소화 및 결찰

0.2ml 원심분리용 튜브에, 추가하다:

• 약 250ng 템플릿 DNA,
• 2.5μl 10× 제한 효소 분해 완충액,
• 2.5μl 10× T4 DNA 리가제 완충액,
• 5 EcoRI 단위,
• 5 MseI 단위,
• 2 T4 DNA 리가아제 단위,
• 50pmol MseI 어댑터,
• 25μl의 총 부피로 이중 증류수.

밤새 37°C로 설정된 PCR 열자전거 장치에서 혼합물을 배양합니다.. 소화 후, 65°C에서 배양하여 효소를 비활성화합니다. 20 분. 사전 증폭 템플릿으로 추가로 사용하려면 반응물을 -20°C에 보관하세요..

3. 사전 증폭

효소 분해 및 결찰된 산물 3μl를 취하여 첨가합니다.:

• 75E+A 프라이머 ng,
• 75M+C 프라이머 ng,
• 15mM Mg2+,
• 25mM dNTP,
• 1 단위 Taq 중합효소,
• 310× PCR 완충액 1μl,
• 이중 증류수를 총 부피 30μl에 추가합니다..

PCR 반응 매개변수를 다음과 같이 설정합니다.:

• 94°C에서 초기 변성 90 초,
• 94°C에서 변성 30 초,
• 56°C에서 어닐링 1 분,
• 72°C에서 확장 1 분,
• 위 단계를 반복하여 30 사이클,
• 72°C에서 최종 연장 10 분 (사용하여 PCR 기계 PE 회사에서).

반응 후, 전기영동을 통해 증폭 산물을 분석합니다. 0.8% 아가로스 젤 (0.5μg/ml EB 함유). 본 제품 3μl를 취해 희석하여 사용하세요. 50 선택적 증폭을 위한 템플릿으로 추가 사용 시간.

4. 선택적 PCR 증폭

희석한 제품 3μl를 취해 첨가하세요.:

• 75EcoR1 선택적 프라이머의 ng,
• 75MseI 선택적 프라이머 ng,
• 15mM Mg2+,
• 25mM dNTP,
• 1 Taq 중합효소 단위,
• 310× PCR 완충액 1μl,
• 이중 증류수를 총 부피 30μl에 추가합니다..

PCR 반응 매개변수를 다음과 같이 설정합니다.:

• 94°C에서 초기 변성 90 초,
• 94°C에서 변성 30 초,
• 65°C에서 어닐링 1 분, 그런 다음 수행 13 사이클 (사이클당 온도를 0.7°C씩 낮춥니다.),
• 94°C에서 변성 30 초,
• 56°C에서 어닐링 1 분,
• 72°C에서 확장 1 분, 그런 다음 수행 25 사이클,
• 72°C에서 최종 연장 5 분 (PE사의 PCR 장비를 이용하여).

첫 번째, 전기영동에 의한 선택적 증폭 산물을 분석합니다. 0.8% 아가로스 젤 (0.5μg/ml EB 함유).

5. 겔 전기영동

증폭된 산물을 분리합니다. 6% 변성 폴리아크릴아미드 젤 (0.5mm 두께) 및 1× TBE 전기영동 완충액 (BIO-RAD 서열분석 전기영동 장치).

• 빗을 제거하고 140W의 일정한 전력으로 젤을 미리 작동시킵니다. 30 온도가 47~49°C에 도달할 때까지 몇 분. 각 우물에서 요소를 씻어내십시오..
• 선택적 증폭 제품의 경우, 동일한 양의 로딩 버퍼 추가 (98% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.25% 자일렌시아놀, 0.25% 브로모페놀블루) 94°C에서 변성됩니다. 5 분 (PE사의 PCR 장비를 이용하여). 변성 후, 로드할 때까지 빠르게 얼음 위에 놓습니다..
• 각 레인에 각 샘플 8μl를 로드합니다.. 처음에는, 약 100W의 일정한 전력으로 젤을 작동시킵니다. 2 몇 분 안에 샘플을 웰 바닥에 빠르게 농축할 수 있습니다.. 그런 다음 60W의 일정한 전력으로 조정하십시오., 온도를 약 43°C로 유지, 브로모페놀 블루가 거의 도달할 때까지 2/3 젤 상단에서 유리판까지의 거리. 전기영동을 종료합니다.

6. 은색 염색

• 고정 솔루션: 탈이온수 또는 이중 증류수 900ml에 빙초산 100ml를 첨가합니다..
• 염색 솔루션: 탈이온수 1L에 AgNO3 1g을 녹입니다., 그런 다음 추가 1.5 ml의 37% 포름알데히드.
• 솔루션 개발: Na2CO3 30g을 녹입니다., 1.5 ml의 37% 포름알데히드, 탈이온수 1L에 티오황산나트륨 2mg을 첨가한 것입니다..

1. 전기영동 후, 은색 염색을 위해 젤이 담긴 유리판을 플라스틱 트레이에 넣습니다..
2. 정착: 고정액을 첨가하고 셰이커에서 가볍게 흔들어 줍니다. 30 분. 고정 후 고정액 예약.
3. 헹굼: 젤을 탈이온수로 3회 세척하세요. 2 매번 분.
4. 더럽히는 것: 젤을 염색 트레이에 넣고 염색 용액을 붓습니다. (4°C로 유지). 쉐이커에 살짝 흔들어서 30 분. 젤을 탈이온수로 헹군 후 10 초, 현상 트레이로 옮기세요.
5. 개발: 개발 솔루션 추가 (4°C로 유지) 밴드가 더 이상 늘어나지 않을 때까지 가볍게 흔들어 주세요..
6. 종료: 단계에서 사용한 고정액을 추가합니다. 2 그리고 몇 분 동안 저어주세요.. 최적의 결과가 달성되면 몇 분 동안 증류수로 헹굽니다..
7. 젤과 유리판의 물방울을 제거한 후, 라이트박스 위에 놓고 Nikon 디지털 카메라를 사용하여 촬영했습니다..

요약

완전한 AFLP 실험 절차를 제공해 주셔서 감사합니다.! 질문이 있거나 추가 도움이 필요한 경우, 부담없이 문의해 주세요. 기꺼이 지원과 답변을 제공해 드리겠습니다..