Набор для определения нуклеиновых кислот для определения пола птиц (ПЦР-метод)

• предмет номер： АН2206001
• Спецификация：48Т 100Т

Внедрение продукции：

Этот набор может амплифицировать определенные фрагменты нуклеиновой кислоты из таких образцов, как перья., кровь, и ткани различных птиц (включая Попугаеобразные, Колумбиформные, Галлиформные, Ciconiiformes, Груиформы, и некоторые гусеобразные), с использованием ПЦР.

Он включает в себя антиингибирующую 2× Taq PCR Master Mix. (с красителем) и другие компоненты, необходимые для ПЦР. Амплифицированные продукты могут быть непосредственно подвергнуты электрофорезу в агарозном геле для определения результата..

Содержание продукта：

Условия хранения：

Хранить при -20℃, срок годности не менее 12 месяцы

Обработка образцов:

См. набор для быстрого извлечения геномной ДНК животных. (для ПЦР-анализа) Инструкция по эксплуатации от SanshiBio. (Номер продукта: ДП202) для обработки проб. Сохраните обработанные образцы для последующего использования..

1. Экспериментальная эксплуатация：

• Базовые приготовления (Зона подготовки проб)
• Экстракция нуклеиновой кислоты:
• Следуйте инструкциям из “Набор для быстрого извлечения геномной ДНК животных (для ПЦР-анализа)” или используйте любой другой подходящий набор/метод для экстракции нуклеиновых кислот, отвечающий требованиям.. Извлечение нуклеиновых кислот из обработанных образцов.
• Лучше всего протестировать извлеченные нуклеиновые кислоты как можно скорее.. Держите их на льду, или храните их при температуре 4°C или -20°C, если они не используются немедленно..

2. Подготовка реакционной системы (Область добавления образца)

2.1 Приготовление реакционной смеси:

• Рассчитайте объем необходимых реагентов в зависимости от количества образцов..
• Конкретная подготовка заключается в следующем.: Пипетка (п × 7.5 мкл тестового реагента C + п × 10 мкл тестового реагента D + п × 1 мкл тестового реагента E) в чистую центрифужную пробирку. Тщательно перемешать пипеткой, и аликвота 18 мкл в каждую лунку 0.2 пробирка для ПЦР мл (центрифужная пробирка). (Если образцов много, приготовьте смесь заранее и кратковременно храните ее при температуре 2–8°C.; использовать внутри 2 часы.)

2.2 Добавлять 2 мкл экстрагированной нуклеиновой кислоты образца в каждую реакционную смесь, закройте трубки, запишите детали, и довести общий объем до 20 мкл на реакцию. Хорошо перемешайте и центрифугируйте для 30 секунд перед помещением в ПЦР-машина для усиления.

ПЦР-амплификация (Область амплификации и анализа продуктов)

Протокол ПЦР:

• Начальная денатурация при 94°C для 3 минуты.
• 32 циклы: 94°С для 30 секунды (денатурация), 50°С для 45 секунды (отжиг), 72°С для 50 секунды (расширение).
• Окончательное удлинение при 72°C для 8 минуты, затем выдержать при 4°C.
• Тщательно охладите продукты амплификации при температуре 4°C. (или быстро при -20°C в течение примерно 5 минуты) для 15 минуты.

Электрофорез в агарозном геле(На примере горизонтального электрофореза в агарозном геле)

4.1 Подготовка геля:

В зависимости от количества наносимого геля и концентрации геля. (1%~1,5%), отмерьте соответствующий объем буфера для электрофореза (ТАЕ или ТВЕ, с номерами продуктов DA001 или DA002 соответственно, или эквивалентные продукты, соответствующие требованиям), и переливаем в треугольную колбу.

Примечание: Буфер для литья геля и буфер для электрофореза должны быть одинаковыми..

4.2 Тщательно взвесьте агарозу (Номер продукта: DA003, или аналогичный бренд), и добавим его в колбу. Накройте колбу пергаментной бумагой или герметизирующей пленкой и растворите агарозу, нагрев ее в микроволновой печи.. Нагреть до кипения, надевайте термостойкие перчатки, и аккуратно покрутите колбу. Повторяйте до тех пор, пока агароза полностью не растворится..

Примечание: В процессе растворения агарозы следует использовать несколько кратких кипячений, чтобы предотвратить перегрев и выкипание раствора.. Убедитесь, что агароза полностью растворилась, чтобы избежать нечетких изображений электрофореза..

4.3 Добавить краситель нуклеиновой кислоты (Номер продукта: DA004, или аналогичный бренд) до полностью растворенной агарозы.

4.4 Вылейте раствор агарозы в лоток для заливки геля и вставьте гребенку в соответствующие положения.. Толщина геля должна быть между 3 к 5 мм.

4.5 Дайте гелю затвердеть при комнатной температуре. (о 30 минут до 1 час). Осторожно снимите расческу и поместите гель в резервуар для электрофореза, предварительно заполненный буфером для электрофореза..

Электрофорез и загрузка образца:

4.6 Нагрузка 5 мкл ДНК-маркера (Номер продукта: DA005, или аналогичный бренд) и 10 мкл охлажденных продуктов амплификации в лунки. После загрузки всех образцов, пусть постоит за 2 минут до включения питания. Установите напряжение (70-120В) и время работы (20-30 минуты) согласно условиям.

Интерпретация результата

Определение результатов:

• Если одна полоса появляется примерно на расстоянии 700 б.п., образец определен как мужской.
• Если появляются две усиленные полосы около 700 п.н. и 400 п.н. (или появляется только одна усиленная полоса около 400 п.н.), образец определен как женский.
• Если полосы не видны, специфические гены определения пола птиц в образце не обнаружены. Рекомендуется повторить экстракцию и амплификацию нуклеиновых кислот или обратиться за помощью в техническую поддержку производителя..

Меры предосторожности：

• Чтобы предотвратить загрязнение, эксперимент должен быть строго разделен, с физической изоляцией между различными зонами во избежание перекрестного загрязнения, вызванного человеческим фактором. Во время эксперимента надевайте лабораторные халаты и латексные перчатки., и использовать отдельные инструменты в разных областях. Перчатки и лабораторные халаты следует менять при перемещении между помещениями..
• Реагенты должны быть полностью разморожены перед использованием., но следует избегать повторных циклов замораживания-оттаивания. Строго следуйте инструкциям по приготовлению реагентов и добавлению проб.. Верстаки, центрифуги, пипетки, и другие инструменты необходимо регулярно дезинфицировать хлорсодержащими дезинфицирующими средствами., спирт этиловый, средства обеззараживания нуклеиновых кислот, или УФ лампы.
• После завершения реакции ПЦР, не открывайте крышку сразу. Прежде чем открывать, подождите, пока он достаточно остынет, чтобы максимально избежать аэрозольного загрязнения..
• Этот набор используется только для амплификации определенных генов у некоторых птиц, не относящихся к воробьиным. (домашняя птица), для других сопутствующих товаров, пожалуйста, проконсультируйтесь с Sanli Bio. Этот продукт предназначен только для научных исследований и не предназначен для клинической диагностики или других целей..