Соларбио глутатионпероксидаза (ГШ-Пх/GPX) Набор для анализа активности

Примечание: Перед тестом возьмите два или три разных образца для прогнозирования..

Операционное оборудование: Спектрофотометр

Кот нет: BC1190

Размер: 50Т/24С

Компоненты:

Описание продукта:

• Глутатионпероксидаза (ГПХ), также известный как GSH-Px или GPX, является важнейшим ферментом пероксидазы, широко встречающимся в организме..
• GPX играет важную роль в катализе превращения восстановленного глутатиона. (ГШ) в окисленный глутатион (ГССГ) и в восстановлении токсичной перекиси водорода до нетоксичных гидроксильных соединений..
• Ферментативное действие GPX включает окисление GSH перекисью водорода., в результате чего образуется GSSG.
• GSH реагирует с DTNB с образованием соединений с характерными пиками поглощения при 412 нм.
• Уменьшение поглощения при 412 нм служит индикатором активности GPX.

Требуемые реагенты и оборудование, которые не входят в комплект поставки:

Спектрофотометр, баланс, настольная центрифуга, 1 стеклянная кювета мл, ступка/гомогенизатор, EP трубка.

Процедура

я. Базовые приготовления:

Салфетка:

Коэффициент соответствия Вес ткани (г): Экстракт раствора (мл)=1:5~10 (Рекомендуемое количество 0,05 г ткани с 1 мл раствора экстракта.), гомогенат на ледяной бане. Центрифуга в 5000 об/мин при 4℃ для 10 минуты, возьмите супернатант, и помести его на лед для проверки (Если супернатант непрозрачный, центрифуга для 3 минуты).

Бактерии или клетки

Количество ячеек (104): Экстракт раствора (мл): 500~1000:1 (Добавьте 1 мл раствора экстракта в 5 миллион клеток), ультразвуковой с ледяной баней для разрушения клеток(300Вт,3с, интервал 7 секунд,общее время 3 минуты). Центрифугировали при 5000 об/мин при 4℃ для 10 минуты, возьмите супернатант и поместите его на лед для анализа (Если супернатант непрозрачный, центрифуга для 3 минуты).

Образец сыворотки: Обнаружение напрямую

II. Определение процедура:

1. Предварительно разогрейте спектрофотометр для 30 минуты, отрегулировать длину волны, чтобы 412 нм, и выставляем ноль дистиллированной водой.
2. Стандартное решение 20 мкмоль/мл разбавляли до 0.25 мкмоль/мл с экстракционным раствором. Стандартное решение 100 мкл смешивают с 400 мкл реагента IV, а концентрация стандартного раствора составила 0.05 мкмоль/мл. Стандартный раствор готовят при использовании смеси растворов..
3. Смешайте 150 мкл образца с 150 Реагент µLof I и поместите его при комнатной температуре на 5 минуты.
4. Операционный стол: (1.5 Центробежная пробирка мл со следующими реагентами по очереди).

Центрифуга в 4000 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут и перенесите супернатант в EP-пробирку..

Ну перемешать. Затем помещают при комнатной температуре на 15 минуты, поглощение при 412 нм измеряется. Поглощение записывают как AT, переменного тока, КАК, и АБ, соответственно. Вычислить ΔAT = AC – В, ΔАС= АС – АБ.

III. Расчет:

Расчет процента ингибирования Процент ингибирования =(AC-AT)/(АС-АБ)×100%

насколько это возможно, процент ингибирования образца находится в пределах 30-70%, и чем ближе это к 50%, тем это точнее. Если процент ингибирования меньше 30% или более чем 70%, обычно необходимо скорректировать дозировку и определить ее заново. Если процент ингибирования высок, образец должен быть правильно разбавлен. Если процент ингибирования низкий, пробу с высокой концентрацией следует подготовить заново.

Расчет активности GPX

• Концентрация белка:

Определение единицы измерения: Одна единица активности фермента определяется как количество фермента, которое катализирует окисление 1 нмоль GSH в минуту в реакционной системе., каждый миллиграмм белка.

ГПХ (Ед/мг прот) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×ВЭВ÷(Цпр×ВСВ)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷Cpr

• Вес образца

Определение единицы измерения: Одна единица ферментативной активности определяется как количество фермента, катализирующего окисление 1 нмоль GSH в минуту в реакционной системе, каждый грамм образца.

ГПХ (Е/г веса) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×ВЭВ÷(ВСВ÷ВТВ×Ш)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷W

• Количество ячеек

Определение единицы измерения: Одна единица активности фермента определяется как количество фермента, которое катализирует окисление 1 нмоль GSH в минуту в реакционной системе., каждый 104 клетки.

ГПХ(U/104cell) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×ВЭВ÷(Н×ВСВ÷ВТВ)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷N

• Объем жидкости:

Определение единицы измерения: Одна единица ферментативной активности определяется как количество фермента, катализирующего окисление 1 нмоль GSH в минуту в реакционной системе, каждый миллилитр жидкости.

ГПХ (Ед/мл)=ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷VS÷T=200×ΔAT÷ΔAS.

CS: Концентрация стандартных смесей, 0.08 мкмоль/мл;

ВЭВ: Объем ферментативной реакционной системы, 1.25мл;

Всв: Объем пробы, содержащейся в смесях проб, 0.1 мл; ВТВ: Объем экстракционного раствора, 1 мл;

КПР: Концентрация белка в супернатанте, мг/мл;

Т: Время реакции, 5 минуты;

Н: Количество клеток, десятки тысяч; Вт: Вес образца, г;

1000: 1 мкмоль=1000 нмоль.

Примечание:

1. Когда поглощение превышает 1.2, рекомендуется определять пробу после разбавления экстракцией
2. Не рекомендуется брать слишком много проб за раз., чтобы избежать влияния слишком длительного времени тестирования на развитие цвета, что может привести к тому, что определение не будет

Экспериментальные экземпляры：

• Возьмите 0,1 г мышиной печени., добавьте 1 мл раствора экстракта, гомогенат, и измельчить. Возьмите супернатант, разбавить его на 40 раз, и протестировать по измерениям. Рассчитать AT=0,108., АС=0,303, AS=0,491AB=0,033,∆AT=AC-AT=0,195 ∆AS= AS-AB=0,458, рассчитать активность фермента в зависимости от веса образца:

ГПХ (Е/г веса)=200×ΔAT÷ΔAS÷W×40 (коэффициент разбавления) = 34061 Ед/г.

• Возьмите 1 г листьев тополя., добавьте 1 мл раствора экстракта, гомогенат, и измельчить. Рассчитать АТ=0,220, АС=0,318, АС=0,491, АВ=0,033, ∆AT=AC-AT=0,098,∆AS=AB-AB=0,458, рассчитать активность фермента в зависимости от веса образца:

ГПХ (Е/г веса)=200×ΔAT÷ΔAS÷W=428 Ед/г.