Экстракция РНК земляники для идентификации шести вирусов с использованием метода мультиплексной ПЦР

Фон

Клубника — многолетнее травянистое растение семейства Розовые. (розоцветные) и род Клубника (Фрагария). У них сочная текстура, питательно богаты, широко культивируемый, и их можно есть свежими или переработанными. Клубника – важная экономическая культура.

Обнаружение вируса является важным шагом в предотвращении и борьбе с вирусными заболеваниями, а также в производстве безвирусной рассады.. В настоящее время, не существует эффективного метода лечения вирусных заболеваний растений. Однажды растение в поле заражено вирусом, он остается инфицированным на всю жизнь и не поддается излечению. Поэтому, Обнаружение вируса играет важную роль в устойчивом развитии клубничной отрасли..

Введение

Есть более чем 30 зарегистрированы вирусы, которые могут заразить клубнику. Распространенные из них включают вирус полосатости жилок клубники. (СВБВ), Вирус клубничной пятнистости (Меморандум о взаимопонимании), Вирус клубничной морщинистости (СКВ), и вирус умеренного желтого края клубники (SMYEV). Уровень обнаружения SCV в Китае относительно низок.. Постоянное совершенствование технологий обнаружения и расширение площадей выращивания приводят к обнаружению новых штаммов и типов вирусов в клубнике.. Вирус, ассоциированный с клубничным паллидозом (SPaV) находится в Австралии, Европа, и Америка.

Выполнение специфического обнаружения только одного вируса одновременно с использованием одного ПЦР тест занимает много времени и требует много материалов. Поэтому, важно создать метод обнаружения мультиплексной ПЦР, который может одновременно проверять несколько вирусов..

Мультиплексная ПЦР предполагает добавление нескольких пар праймеров в один. ПЦР-реакция для усиления нескольких шаблонов, позволяющий одновременно обнаруживать различные вирусы. Мультиплексная ПЦР более эффективна и экономична по сравнению с однократной ПЦР.. Создание стабильной системы реакции мультиплексной ПЦР является сложной задачей из-за взаимодействия между праймерами., конкурентное усиление, и разные оптимальные условия амплификации для разных шаблонов. Это требует тщательного выбора и оптимизации конкретных праймеров., условия реакции, и реакционные системы. Мультиплексная ПЦР — это не простая смесь отдельных ПЦР.; дизайн праймеров является решающим фактором, определяющим успех мультиплексной амплификации., и для эффективной дифференциации гель-электрофореза должна быть разница в размерах нескольких полос..

Тотальная экстракция РНК:

Для выделение тотальной РНК из листьев клубники, СЕОН Биотехнология Набор для экстракции РНК используется, следуя предоставленным инструкциям.

Обратная транскрипция:

Процесс обратной транскрипции включает использование обратной транскриптазы M-MuLV от Takara. (Китай) синтезировать кДНК.

Реакционная система включает в себя:

1. РНК: 2 мкл
2. 5× Буфер M-MuLV (Промега): 4 мкл
3. дНТФ смесь (2.5 ммоль): 1 мкл
4. Случайные праймеры (10 мкмоль): 0.5 мкл
5. Олиго (дТ)18 праймеры (10 мкмоль): 0.5 мкл
6. Ингибитор обратной транскриптазы M-MuLV и РНКазы каждый: 0.5 мкл
7. Вода, не содержащая РНКазы, для подпитки системы. 20 мкл
8. После тщательного перемешивания, раствор кратковременно центрифугируют, а затем инкубируют при 37°C в течение 1 час, с последующим хранением при -20°C.

На основе информации о последовательности генов NCBI для SVBV., Меморандум о взаимопонимании, SMYEV, SPaV, СтрВ-1, и БрЯВ, получено из учетных номеров GenBank FM867860.1, AJ311876.1, Д12517.1, МН747002.1, MW795715, и ОН060762, соответственно, консервативные регионы идентифицируются с помощью PrimerPremier. 6.0 для дизайна грунтовки. Длина праймера варьируется от 18 к 25 б.п., и содержание GC находится между 40% и 60%.

Анализ

Было разработано и проверено несколько пар праймеров на SVBV., Меморандум о взаимопонимании, SMYEV, SPaV, СтрВ-1, и БрЯВ. Изначально, концентрации праймеров для всех комбинаций были установлены на уровне 0.125 мкмоль/л. Программа ПЦР-амплификации соответствовала одиночной ПЦР.. После скрининга, идентифицирована комбинация праймеров, способная одновременно обнаруживать шесть вирусов.

Когда концентрации всех шести праймеров были установлены на уровне 0.125 мкмоль/л, Полосы СВБВ были четкими., Банды СМЫЕВа были самыми широкими и яркими., Полосы SPAV были очень яркими., в то время как СМоВ, БрЯВ, и полосы StrV-1 были слабыми.. Регулируя количество капсюлей для SMoV, БрЯВ, и СтрВ-1 при уменьшении сумм для СМЫВ и СПаВ, было определено подходящее соотношение праймеров: СВБВ:Меморандум о взаимопонимании:SMYEV:SPaV:БрЯВ: СтрВ-1 = 5:10:2:3:10:10.

Заключение

В мультиплексной ПЦР, оптимизация температуры отжига, время отжига, температура расширения, и время продления может уменьшить взаимное влияние между праймерами. в этом исследовании, время отжига (30-45 с) и температура расширения (68-72°С) оказал минимальное влияние на мультиплексную реакцию. Однако, температура отжига (50-60°С) и время продления (75-120 с) имели решающее значение для сложившейся реакционной системы. Слишком высокая температура отжига может привести к сбою амплификации некоторых вирусов., вероятно, связано с температурой отжига праймера и стабильностью связывания праймера с матрицей.. Как слишком короткое, так и слишком длительное время продления было неблагоприятным для одновременной амплификации шести вирусов., влияя на выход продукта и увеличивая вероятность неспецифической амплификации. Мультиплексная ПЦР, установленная в этом эксперименте, может идентифицировать SVBV., Меморандум о взаимопонимании, SMYEV, SPaV, СтрВ-1, и BrYV в одной реакции, экономия затрат и времени на обнаружение.