В чем разница между ПЦР и ПЦР в реальном времени? ?

Введение

Полимеразной цепной реакции (ПЦР) произвел революцию в медицинских исследованиях, когда был изобретен в 1980-х годах.. Этот метод использует преимущества естественного процесса репликации ДНК для быстрой амплификации определенных генетических последовательностей для дальнейшего изучения.. ПЦР открыла новые возможности для генетических исследований и клинической диагностики.

Более продвинутая форма ПЦР, называемая ПЦР в реальном времени., позже основанный на этом открытии. ПЦР в реальном времени предоставляет дополнительные возможности, которые делают его идеальным для определенных приложений, где стандартная ПЦР неэффективна..

Понимание того, когда использовать каждый метод, позволяет исследователям оптимизировать эксперименты, а врачам — обеспечить лучший уход за пациентами..

Что такое традиционная ПЦР и почему это важно?

Кэри Маллис впервые обнаружил ПЦР, когда ехал по залитому лунным светом шоссе.. Этот метод, получивший Нобелевскую премию, использует естественный процесс репликации ДНК для экспоненциальной амплификации целевых генетических последовательностей in vitro..

ПЦР позволила ученым изучать мельчайшие генетические образцы, которые невозможно обнаружить другими способами.. Это также обеспечило быстрое, доступная альтернатива экспериментам по клонированию ДНК, которые раньше занимали недели или месяцы.

Как работает традиционная ПЦР?

ПЦР состоит из повторяющихся температурных циклов, способствующих денатурации ДНК., отжиг праймера, и расширение последовательности с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. После 30-40 циклы, существует достаточное количество копий для анализа и последующих приложений.

Процесс включает в себя три ключевых этапа:

● Денатурация: Нагревание разделяет двойную спираль ДНК на отдельные нити.
● Отжиг: Охлаждение позволяет праймерам связываться с комплементарными последовательностями.
● Расширение: ДНК-полимераза синтезирует новые цепи с помощью праймеров.

Затем цикл повторяется, при этом количество копий целевой ДНК удваивается каждый раунд. После 30+ циклы, существует более миллиарда копий.

Для чего можно использовать традиционный ПЦР?

ПЦР открыла новые возможности в генетических исследованиях и клинической диагностике благодаря своей надежности., адаптивность, и простота.

Использование этой ПЦР включает в себя:

● Обнаружение генетических мутаций.
● Клонирование и секвенирование ДНК.
● Анализ судебно-медицинских доказательств.
● Диагностика возбудителей и заболеваний

Какие ограничения имеет традиционный ПЦР?

В то время как традиционная ПЦР качественно обнаруживает целевую последовательность, ему не хватает возможностей количественной оценки. Методы обнаружения конечной точки подтверждают только наличие или отсутствие амплификации.. У исследователей не было инструмента для количественного измерения генетических биомаркеров для таких приложений, как:

● Точный анализ экспрессии генов.
● Выявление минимальной остаточной болезни при раке
● Мониторинг вирусной нагрузки инфекций
● Высокопроизводительный генетический скрининг

что такое ПЦР в реальном времени и когда она была разработана?

ПЦР в реальном времени, также называется количественной ПЦР (кПЦР), наконец, в начале 1990-х годов в ПЦР были реализованы абсолютные возможности количественного определения ДНК..

Специализированные инструменты обнаруживают флуоресценцию ДНК-связывающих красителей или зондов, специфичных для последовательности, при каждом температурном цикле.. Программное обеспечение генерирует графики амплификации в реальном времени, используемые для точного количественного определения исходной ДНК..

Как работает ПЦР в реальном времени?

ПЦР в реальном времени включает флуоресцентные репортерные красители или специфичные для последовательностей зонды, позволяющие количественно определять ДНК во время амплификации.. Ключевыми шагами являются:

● Флуоресцентные метки интеркалируются или гибридизуются для амплификации ДНК.
● специализированные инструменты обнаруживают флуоресценцию в каждом цикле
● программное обеспечение генерирует графики амплификации
● Количественный анализ рассчитывает абсолютные начальные уровни ДНК.
Таким образом, путем мониторинга флуоресценции на протяжении всего процесса экспоненциальной амплификации, ПЦР в реальном времени облегчает чувствительное количественное обнаружение.

Какие преимущества это дает?

В то время как стандартная ПЦР качественно обнаруживает генетическую последовательность, ПЦР в реальном времени во время амплификации позволяет количественно определить исходное количество посредством флуоресценции..

Это ключевое отличие делает ПЦР в реальном времени идеальной для:

● Точное измерение экспрессии генов.
● Выявление минимальной остаточной болезни
● Мониторинг вирусной нагрузки
● Диагностический скрининг
● Высокопроизводительный генетический анализ.

Как ПЦР в реальном времени обеспечивает количественное обнаружение?

ПЦР в реальном времени облегчает точный количественный анализ ДНК за счет использования флуоресцентных репортерных систем, которые взаимодействуют с амплифицирующими цепями ДНК.. Существует два основных типа:

• Неспецифические ДНК-красители
  Флуоресцентные красители, такие как СИБР Зеленый может связываться и интеркалироваться в любую двухцепочечную ДНК.. Поскольку амплификация во время ПЦР происходит экспоненциально, накапливается больше меченой ДНК, и интенсивность флуоресценции пропорционально увеличивается.. Специализированные инструменты контролируют эту интенсивность после каждого цикла.. Путем определения цикла, в котором флуоресценция превышает фоновую (Cq), программа рассчитывает абсолютное количество исходной ДНК

• специфичные для последовательности зонды
  Специфические для последовательностей зонды, такие как зонды TaqMan и молекулярные маяки, связываются только с целевыми последовательностями ДНК и определяют их количество.. Эти зонды содержат флуоресцентный репортерный краситель и молекулу-гаситель.. При привязке к цели, репортерская флуоресценция гаснет. Во время усиления, активность полимеразы высвобождает зонд, изолируя репортера от тушителя и испуская флуоресценцию.

Чем ПЦР в реальном времени лучше традиционной ПЦР?

ПЦР в реальном времени повышает чувствительность традиционной ПЦР., специфика, и скорость:

● Количественно определяет начальные уровни ДНК посредством флуоресценции.
● Повышенная чувствительность и точность.
● Более быстрое получение результатов без этапов пост-ПЦР.
● Более высокая производительность при использовании многолуночных планшетов.
● Автоматизация повышает воспроизводимость.

Таким образом, для любого применения, требующего чувствительной количественной оценки или быстрого анализа, RT-ПЦР превосходит обычную ПЦР.

Сравнение традиционной ПЦР и ПЦР в реальном времени

Вот сравнение традиционной ПЦР и ПЦР в реальном времени, которое может помочь вам сделать выбор между двумя традиционными ПЦР и ПЦР в реальном времени. :

Особенность	Традиционная ПЦР	ПЦР в реальном времени
Принцип	Экспоненциальная амплификация целевой последовательности ДНК	Амплификация и одновременная количественная оценка
Количественная оценка	Качественный (да/нет обнаружения)	Количественный (абсолютные суммы)
Метод обнаружения	Гель-электрофорез или обнаружение флуоресценции после амплификации	Мониторинг флуоресценции во время амплификации
Мониторинг реакции	Только конечная точка	В режиме реального времени, после каждого цикла усиления
Скорость	Умеренный, требуется пост-ПЦР обработка	Быстрота благодаря сбору данных в реальном времени
Чувствительность	Высокий	Very high – can detect 1-10 копии
Специфика	Высокий	Очень высокий из-за зондов, специфичных для последовательности
Воспроизводимость	Высокий	Очень высокий при автоматизированной обработке жидкостей
Пропускная способность	Умеренный	Высокий, использует многолуночные планшеты
Инструментарий	Термический циклер	Термоциклер реального времени + компьютер
Основные приложения	Клонирование генов, генотипирование, обнаружение мутаций	Анализ экспрессии генов, диагностика, количественное определение вируса

Что рекомендуют большинство клиницистов между традиционной ПЦР и ПЦР в реальном времени?

И стандартная ПЦР, и ПЦР в реальном времени произвели революцию в исследованиях и диагностике, сделав возможным чувствительный генетический анализ.. Однако, Многие ученые и врачи рекомендуют ОТ-ПЦР вместо традиционной ПЦР для задач, требующих:

● Абсолютное количественное определение уровней ДНК.
● Быстрые результаты в клинических условиях.
● Возможности высокопроизводительного тестирования.
● Максимальная чувствительность обнаружения

Для качественного обнаружения, традиционная ПЦР – лучший метод. Но точность и скорость RT-PCR сделали его важным инструментом в генетических исследованиях и молекулярной диагностике..

Последняя мысль

хотя оба метода обеспечивают чувствительную и специфическую амплификацию ДНК., ПЦР в реальном времени предоставляет дополнительные возможности, такие как абсолютный количественный анализ., более высокая пропускная способность, увеличенная скорость, и чувствительность, которые делают его идеальным для определенных применений в исследованиях и молекулярной диагностике.. Выбор зависит в первую очередь от необходимости количественного определения по сравнению с простым качественным обнаружением..