Что такое лестница ДНК? Что делает лестница ДНК в ПЦР?

Полимеразной цепной реакции (ПЦР) произвел революцию в исследованиях и диагностике молекулярной биологии. Этот универсальный метод позволяет экспоненциально амплифицировать целевые последовательности ДНК всего за несколько часов.. Но как узнать, сработал ли ваш ПЦР?? И если вы создали ожидаемый продукт, как определить его точный размер? Вот тут-то и приходят на помощь лестницы ДНК..

Что такое лестница ДНК?

Лестница ДНК содержит фрагменты ДНК известных, конкретные размеры. Как линейка с разметкой в ​​дюймах или сантиметрах., лестница ДНК действует как эталон размера при проведении гель-электрофореза. Сравнивая полосы образцов ПЦР с фрагментами лестницы., вы можете оценить размер неизвестных вам фрагментов ДНК.

Лестницы ДНК состоят из молекул ДНК, начиная от 100 пар оснований более чем 10,000 пар оснований. Фрагменты часто кратны 100 или 1,000 пар оснований. Лестницы с интервалами 100 bp лучше всего подходят для определения размера небольших продуктов ПЦР., пока 1 лестницы kb лучше работают для более крупных ампликонов.

Как устроена лестница ДНК?

Хотя готовые лестницы можно приобрести, вы также можете создать свою лестницу ДНК в лаборатории. Вот некоторые распространенные способы приготовления:

• Рестриктивные ферменты переваривают плазмидная ДНК– Плазмиды разрезаются ферментами, такими как HindIII или EcoRI, для высвобождения фрагментов определенного размера..
• Амплификация методом ПЦР– Целевые последовательности различной длины амплифицируются индивидуально, а затем объединяются в лестницу..
• Частичное переваривание конкатамеров– Тандемные повторы последовательности ДНК расщепляются с образованием мультимеров..
• Гибридизация синтетических олигонуклеотидов– Короткие одноцепочечные фрагменты ДНК отжигаются в двухцепочечные мультимеры..

Независимо от способа производства, Ключом является создание набора дискретных полос, охватывающих желаемый диапазон размеров..

Как используется лестница ДНК?

Теперь, когда вы понимаете, что такое лестница ДНК., как он используется? Лестницы ДНК служат двум важным целям:

1. Оценка размера

Используя лестницу ДНК вместе с образцами ПЦР на агарозном или полиакриламидном геле., вы можете оценить размер неизвестных вам фрагментов ДНК.

Во время электрофореза, лестница и образцы мигрируют через гелевую матрицу со скоростью, зависящей от их размера. Меньшие фрагменты перемещаются дальше по гелю., в то время как более крупные фрагменты отстают.

Когда ДНК окрашивается и визуализируется, фрагменты лестницы кажутся острыми, дискретные полосы. Выстраивая полосы выборки с полосами лестницы соответствующего размера., вы можете определить примерную длину ваших ПЦР-продуктов.

2. Контроль качества

Включение лестницы ДНК также служит визуальным контролем того, что ваша ПЦР-амплификация сработала.. Когда вы наблюдаете отдельные полосы выборки, мигрирующие в ожидаемых положениях относительно лестницы, это обеспечивает быстрое подтверждение того, что ваш ПЦР прошел успешно..

Если вы не видите ни одной группы, лестница указывает на то, что сам электрофорез был проведен правильно. Это говорит о том, что ваша реакция ПЦР могла оказаться неудачной и необходимо устранить неполадки..

ДНК-лестницу какого размера мне следует использовать?

Благодаря разнообразию доступных лестниц ДНК, как выбрать подходящий для своего эксперимента? Вот ключевые факторы, которые следует учитывать:

• Диапазон размеров– Диапазон лестниц должен охватывать ожидаемые размеры продуктов для ПЦР.. Для ампликонов под 1 КБ, а 100 б.п. или 1 КБ лестница подходит. Для более крупных продуктов, выберите более высокую лестницу, например 5 КБ или 10 КБ.
• Расстояние между полосами– Лестницы с большим количеством контрольных полос в заданном диапазоне размеров обеспечивают большую точность определения размеров.. Однако, близко расположенным полосам требуется больше времени для полного разрешения. Если время ограничено или вам нужны только приблизительные размеры, используйте лестницу с меньшим количеством фрагментов.
• Готов к загрузке– готовый, готовые к загрузке лестницы гарантируют точную интенсивность полос. Не разбавляйте и не смешивайте лестницы самостоятельно..
• Номер образца– Для нескольких образцов, выберите больший размер лестничной полосы, чтобы обеспечить возможность параллельного сравнения.
• Бюджет – Учитывайте стоимость при производстве больших объемов гелей.. Некоторые лестницы более экономичны..

Как мне прочитать лестницу ДНК?

Как только ваш гель визуализируется после электрофореза, как читать лестницу, чтобы определить размеры продуктов ПЦР? Следуй этим шагам:

1. Определите дорожки, содержащие фрагменты лестницы ДНК.. Обычно он загружается в первую и/или последнюю полосу..
2. Обратите внимание на размер полос ДНК пар оснований в соответствии со справочной таблицей производителя лестницы.. Лестницы имеют цветовую маркировку для удобства чтения..
3. Сравните неизвестные полосы сэмплов с лестницей, определение ближайшей полосы на лестничной полосе. Размер вашей группы примерно соответствует этому фрагменту лестницы..
4. Для большей точности, интерполировать размер полосы между двумя фрагментами лестницы. Например, если ваша группа бежит между 500 и 600 лестничные полосы bp, оцените его размер как 550 б.п..
5. Для повышения точности размеров, используйте гели дольше, чтобы максимизировать разделение между лестничными полосами. Загрузка меньшего количества лестничных диаграмм также может улучшить разрешение полосы..

Каковы примеры часто используемых лестниц ДНК??

Многие типы ДНК-лестниц доступны у таких производителей, как New England Biolabs., ТермоФишер, и Инвитроджен. Некоторые часто используемые параметры включают в себя:

• 100 лестница ДНК bp – Содержит 12 фрагменты из 100 б.п. до 1,500 б.п.. Идеально подходит для продуктов ПЦР под 1,000 б.п..
• 1 лестница ДНК кб– Состоит из 13 группы из 250 б.п. до 10,000 б.п.. Хорошо подходит для ампликонов до 10 КБ.
• 1 kb Plus ДНК-лестница– Расширенная версия 1 лестница kb с дополнительными высокомолекулярными и низкомолекулярными фрагментами.
• Лестница ДНК FastDigest– Предварительно переваренная лестница, готовая к непосредственной загрузке в гели. Меньшее количество полос обеспечивает быстрое время работы.
• Лестница ДНК с высокой молекулярной массой – Содержит более крупные фрагменты ДНК до 48,500 bp для определения размера геномной ДНК с высокой молекулярной массой.

Как подготовить и загрузить лестницу ДНК?

Чтобы использовать все преимущества вашей лестницы ДНК, правильная подготовка и методы загрузки являются ключевыми моментами:

• Перед использованием проверьте целостность лестницы. – Проверьте, нет ли размазывания или деградации полос..
• Аккуратно перемешайте – Избегайте энергичного встряхивания, чтобы предотвратить разрыв ДНК..
• Используйте рекомендованные производителем количества. – Недогрузка дает слабую интенсивность полосы.. Перегрузка вызывает насыщение.
• Загрузите лестницу в первой и/или последней полосе движения. – Предоставляет ссылку на размер на обеих сторонах ваших образцов..
• Включить полосу без лестницы – Служит средством контроля загрязнения.

Следуя этим рекомендациям, вы всегда будете получать оптимальную производительность лестницы..

Как мне создать свою лестницу ДНК?

Хотя покупка готовых лестниц – самый простой путь., вы также можете построить свою ДНК-лестницу с помощью ПЦР и рестрикционного расщепления.. Вот обзор процесса:

1. Разработайте праймеры для ПЦР для амплификации определенных целевых последовательностей различной длины., такой как 500, 750, 1,000, и 1,500 б.п..
2. Выполните отдельные ПЦР с использованием каждой пары праймеров для создания фрагментов ДНК определенного размера..
3. Очистите продукты ПЦР и определите концентрацию ДНК для каждого фрагмента..
4. Переварите фрагменты одним и тем же ферментом рестрикции для создания совместимых липких концов..
5. Смешайте фрагменты в определенных молярных соотношениях для достижения желаемой интенсивности полос..
6. Лигируйте фрагменты с образованием мультимеров, разделенных сайтами рестрикции..
7. Усиливайте, используя универсальные праймеры для создания конкатамеров..
8. Частично переваривать конкатамеры с помощью оригинального фермента рестрикции для разрезания внутренних участков..
9. Очистите и смешайте дайджесты в окончательную лестницу ДНК..

Почему лестницы ДНК так важны для ПЦР?

Лестницы ДНК необходимы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) приложений по нескольким ключевым причинам:

Точность и воспроизводимость

ДНК-лестницы обеспечивают точный размер и стабильную воспроизводимость результатов ПЦР.. Сравнивая ваши полосы со стандартами молекулярной массы лестницы., вы можете точно определить размер ампликона и подтвердить успешную целевую амплификацию. Это позволяет надежно воспроизводить результаты для разных пользователей., оборудование, и лаборатории.

Стандартизация

Включение лестницы ДНК стандартизирует сравнение нескольких образцов ПЦР.. Независимо от того, анализируете ли вы различные состояния одного образца или проверяете множество образцов пациентов., лестница обеспечивает постоянную ссылку для оценки результатов. Стандартизация имеет решающее значение для согласованности исследований и клинической диагностики..

Оптимизация

Лестницы облегчают оптимизацию ПЦР, указывая, происходит ли амплификация ожидаемым образом.. Неожиданные размеры полос или слабая интенсивность указывают на неоптимальные условия.. Лестница помогает в протоколах устранения неполадок для получения лучших праймеров., условия езды на велосипеде, и чистота образца.

Чувствительность

С широкой лестницей, даже слабые полосы ПЦР можно визуализировать и определить их размер. Это позволяет обнаруживать малое количество копий шаблонов, что критически важно для таких приложений, как мониторинг вирусной нагрузки.. Чувствительность, обеспечиваемая лестницей, позволяет использовать ПЦР для обнаружения одиночных молекул..

Мультиплексирование

Для мультиплексной ПЦР с несколькими наборами праймеров, лестницы проверяют идентичность каждой целевой группы. Это обеспечивает эффективную амплификацию нескольких последовательностей в одной реакции..

Автоматизация

ДНК-лестницы позволяют автоматически программно анализировать ПЦР-гели. Компьютерные алгоритмы используют лестницу для нормализации различий в миграции полос между гелями.. Это обеспечивает высокую пропускную способность, быстрый анализ большого количества образцов.

Суммируя, Лестницы ДНК повышают точность ПЦР, воспроизводимость, стандартизация, оптимизация, чувствительность, возможность мультиплексирования, и автоматизация. Совершенствуете ли вы новый протокол или анализируете клинические образцы, этот важный инструмент усилит ваш успех и поддержит отличные результаты исследований..