Полимеразной цепной реакции (ПЦР) произвел революцию в исследованиях и диагностике молекулярной биологии. Этот универсальный метод позволяет экспоненциально амплифицировать целевые последовательности ДНК всего за несколько часов.. Но как узнать, сработал ли ваш ПЦР?? И если вы создали ожидаемый продукт, как определить его точный размер? Вот тут-то и приходят на помощь лестницы ДНК..
Лестница ДНК содержит фрагменты ДНК известных, конкретные размеры. Как линейка с разметкой в дюймах или сантиметрах., лестница ДНК действует как эталон размера при проведении гель-электрофореза. Сравнивая полосы образцов ПЦР с фрагментами лестницы., вы можете оценить размер неизвестных вам фрагментов ДНК.
Лестницы ДНК состоят из молекул ДНК, начиная от 100 пар оснований более чем 10,000 пар оснований. Фрагменты часто кратны 100 или 1,000 пар оснований. Лестницы с интервалами 100 bp лучше всего подходят для определения размера небольших продуктов ПЦР., пока 1 лестницы kb лучше работают для более крупных ампликонов.
Хотя готовые лестницы можно приобрести, вы также можете создать свою лестницу ДНК в лаборатории. Вот некоторые распространенные способы приготовления:
Независимо от способа производства, Ключом является создание набора дискретных полос, охватывающих желаемый диапазон размеров..
Теперь, когда вы понимаете, что такое лестница ДНК., как он используется? Лестницы ДНК служат двум важным целям:
Используя лестницу ДНК вместе с образцами ПЦР на агарозном или полиакриламидном геле., вы можете оценить размер неизвестных вам фрагментов ДНК.
Во время электрофореза, лестница и образцы мигрируют через гелевую матрицу со скоростью, зависящей от их размера. Меньшие фрагменты перемещаются дальше по гелю., в то время как более крупные фрагменты отстают.
Когда ДНК окрашивается и визуализируется, фрагменты лестницы кажутся острыми, дискретные полосы. Выстраивая полосы выборки с полосами лестницы соответствующего размера., вы можете определить примерную длину ваших ПЦР-продуктов.
Включение лестницы ДНК также служит визуальным контролем того, что ваша ПЦР-амплификация сработала.. Когда вы наблюдаете отдельные полосы выборки, мигрирующие в ожидаемых положениях относительно лестницы, это обеспечивает быстрое подтверждение того, что ваш ПЦР прошел успешно..
Если вы не видите ни одной группы, лестница указывает на то, что сам электрофорез был проведен правильно. Это говорит о том, что ваша реакция ПЦР могла оказаться неудачной и необходимо устранить неполадки..
Благодаря разнообразию доступных лестниц ДНК, как выбрать подходящий для своего эксперимента? Вот ключевые факторы, которые следует учитывать:
Как только ваш гель визуализируется после электрофореза, как читать лестницу, чтобы определить размеры продуктов ПЦР? Следуй этим шагам:
Многие типы ДНК-лестниц доступны у таких производителей, как New England Biolabs., ТермоФишер, и Инвитроджен. Некоторые часто используемые параметры включают в себя:
Чтобы использовать все преимущества вашей лестницы ДНК, правильная подготовка и методы загрузки являются ключевыми моментами:
Следуя этим рекомендациям, вы всегда будете получать оптимальную производительность лестницы..
Хотя покупка готовых лестниц – самый простой путь., вы также можете построить свою ДНК-лестницу с помощью ПЦР и рестрикционного расщепления.. Вот обзор процесса:
Лестницы ДНК необходимы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) приложений по нескольким ключевым причинам:
ДНК-лестницы обеспечивают точный размер и стабильную воспроизводимость результатов ПЦР.. Сравнивая ваши полосы со стандартами молекулярной массы лестницы., вы можете точно определить размер ампликона и подтвердить успешную целевую амплификацию. Это позволяет надежно воспроизводить результаты для разных пользователей., оборудование, и лаборатории.
Включение лестницы ДНК стандартизирует сравнение нескольких образцов ПЦР.. Независимо от того, анализируете ли вы различные состояния одного образца или проверяете множество образцов пациентов., лестница обеспечивает постоянную ссылку для оценки результатов. Стандартизация имеет решающее значение для согласованности исследований и клинической диагностики..
Лестницы облегчают оптимизацию ПЦР, указывая, происходит ли амплификация ожидаемым образом.. Неожиданные размеры полос или слабая интенсивность указывают на неоптимальные условия.. Лестница помогает в протоколах устранения неполадок для получения лучших праймеров., условия езды на велосипеде, и чистота образца.
Чувствительность
С широкой лестницей, даже слабые полосы ПЦР можно визуализировать и определить их размер. Это позволяет обнаруживать малое количество копий шаблонов, что критически важно для таких приложений, как мониторинг вирусной нагрузки.. Чувствительность, обеспечиваемая лестницей, позволяет использовать ПЦР для обнаружения одиночных молекул..
Для мультиплексной ПЦР с несколькими наборами праймеров, лестницы проверяют идентичность каждой целевой группы. Это обеспечивает эффективную амплификацию нескольких последовательностей в одной реакции..
ДНК-лестницы позволяют автоматически программно анализировать ПЦР-гели. Компьютерные алгоритмы используют лестницу для нормализации различий в миграции полос между гелями.. Это обеспечивает высокую пропускную способность, быстрый анализ большого количества образцов.
Суммируя, Лестницы ДНК повышают точность ПЦР, воспроизводимость, стандартизация, оптимизация, чувствительность, возможность мультиплексирования, и автоматизация. Совершенствуете ли вы новый протокол или анализируете клинические образцы, этот важный инструмент усилит ваш успех и поддержит отличные результаты исследований..
я. Objective Learn and master the basic principles and detection methods of Restriction Fragment Length…
In 1974, Evans first combined chromosome banding techniques with in situ hybridization to improve localization…
Introduction of Situ PCR In scientific research, the establishment of each new technology brings forth…
With the development of molecular biology techniques, various methods for detecting gene structures and mutations…
Introduction AFLP is a DNA molecular marker technology that detects DNA polymorphism by restricting the…
In-situ PCR, or in-situ polymerase chain reaction, is a technique used in scientific research. Each…