Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ) являются важными компонентами полимеразной цепной реакции (ПЦР). dNTP служат строительными блоками, которые позволяют осуществлять репликацию ДНК.. В течение ПЦР, dNTPs позволяют амплифицировать целевые последовательности ДНК. Понимание того, что такое dNTP и их функции, является ключом к пониманию ПЦР..
Что означает dNTP?
dNTP означает дезоксирибонуклеотидтрифосфат.. Дезоксирибонуклеотиды — это мономеры, из которых состоит ДНК.. Каждый дезоксирибонуклеотид состоит из:
- Азотистое основание: аденин (А), тимин (Т), цитозин (С), или гуанин (г).
- Молекула сахара дезоксирибозы.
- Трифосфатная группа.
«Дезокси»’ префикс указывает, что сахарный компонент представляет собой дезоксирибозу, а не рибозу.. У дезоксирибозы нет атома кислорода на 2-м конце.′ углерод.
Трифосфат относится к трем фосфатам, присоединенным к 5′ углерод в сахаре. Наличие трех фосфатных групп делает молекулы dNTP высокоэнергетическими..
Сколько типов дНТФ?
Существует четыре разных dNTP., по одному на каждое из оснований ДНК:
- дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат
- дТТП –дезокситимидинтрифосфат
- dCTP –дезоксицитидинтрифосфат
- дГТФ –дезоксигуанозинтрифосфат
Эти четыре дНТФ являются основными строительными блоками, необходимыми для синтеза новых цепей ДНК..
Что такое дНТФ в биологии?
В биологии, dNTP играют центральную роль в репликации ДНК и ПЦР.:
Репликация ДНК
Во время репликации ДНК внутри клеток, dNTP встраиваются в новые цепи ДНК по мере их синтеза.. Двухцепочечная спираль ДНК раскручивается и распадается на две одиночные цепи.. Каждая цепь действует как шаблон для создания новой дополнительной цепи..
ДНК-полимераза добавляет dNTP, комплементарные цепи матрицы., связывание посредством спаривания оснований. Когда базы соединяются, сахарофосфатные цепи dNTP связаны друг с другом..
Это продолжается до тех пор, пока обе новые цепи не станут полными копиями исходной молекулы ДНК.. dNTP предоставляют необходимые компоненты для построения новых цепей ДНК..
Полимеразной цепной реакции
В ПЦР, dNTP выполняют ту же функцию, что и при репликации ДНК.. ПЦР имитирует репликацию клеточной ДНК в пробирке. Целевая последовательность ДНК многократно копируется с использованием циклов нагревания и охлаждения..
В каждом цикле, ДНК-полимераза добавляет дНТФ для создания новых цепей, комплементарных разделенным цепям матрицы.. Это экспоненциально усиливает целевую область.. dNTP позволяют быстро синтезировать миллиарды копий сегмента ДНК..
ПЦР не могла бы работать без dNTP для полимеризации новых цепей ДНК..
Как dNTP работают в ПЦР?
dNTP являются важным реагентом, позволяющим проводить ПЦР-амплификацию.. Вот обзор того, как функционируют dNTP на каждом этапе ПЦР.:
Денатурация
На начальном этапе денатурации, двухцепочечную ДНК нагревают до 94-98°С.. Водородные связи между комплементарными цепями разрываются., образование двух одноцепочечных молекул ДНК.
Отжиг
Температуру реакции снижают до 50-65°C, чтобы обеспечить отжиг праймера.. Прямые и обратные праймеры связываются с комплементарными последовательностями, фланкирующими целевой участок ДНК..
Расширение/Удлинение
На этом этапе, ДНК-полимераза добавляет дНТФ к праймерам., синтез новых нитей, дополняющих нити матрицы. Температура повышается до 72°С., идеальная температура для Taq-полимераза ферментативная активность.
Taq-полимераза объединяет dNTP в пару оснований с открытыми основаниями матрицы.. По мере добавления каждого dNTP, между ним и растущей цепью ДНК образуется фосфодиэфирная связь.
Это продолжается до тех пор, пока не будет сформирована полная комплементарная последовательность.. В результате получаются две новые копии двухцепочечной ДНК, содержащие целевой участок..
Повторение
Термический цикл повторяется – нагрев для разделения прядей, охлаждение для отжига праймера, и полимеразно-опосредованное расширение с использованием dNTP.
Каждый цикл удваивает количество копий ДНК.. После 30-40 циклы, создаются миллионы копий цели.
dNTP, добавляемые на каждой фазе расширения, обеспечивают экспоненциальную амплификацию.. Без дНТФ, новые цепи ДНК не могли быть синтезированы.
Что произойдет, если дНТФ исключить из ПЦР?
dNTP необходимы и необходимы для ПЦР. Если dNTP не добавлены в мастер-микс ПЦР, реакция будет неудачной.
Без дНТФ, Taq-полимераза не имеет нуклеотидов, которые можно было бы добавить к праймерам.. Поэтому, удлинение новых цепей ДНК не может произойти. Целевая ДНК вообще не будет амплифицирована..
Отсутствие dNTP означает, что ПЦР не будет работать., период. Только праймеры и ДНК-матрица останутся без амплификации..
Контрольная реакция без dNTP может быть полезна для подтверждения того, что синтез ДНК зависит от dNTP.. Но обычно, полное отсутствие dNTP является автоматическим неудачным экспериментом ПЦР..
Почему ddNTP используются при секвенировании ДНК?
В реакциях секвенирования ДНК, слегка модифицированные дезоксинуклеотиды, называемые дидезоксинуклеотидами. (ддНТП) используются. ddNTP отличаются тем, что содержат атом водорода на 3-й позиции.′ углерод, а не гидроксильная группа.
Это 3′ водород предотвращает образование следующей фосфодиэфирной связи. Когда ddNTP включается ДНК-полимеразой, наращивание прядей прекращается.
Используя соотношение dNTP и ddNTP, происходит случайное завершение, генерация фрагментов ДНК различной длины. Затем их можно разделить по размеру, чтобы восстановить исходную последовательность..
ddNTP позволяют секвенировать ДНК, резко останавливая синтез определенных оснований.. По сравнению с обычными dNTP, ddNTP не хватает 3′ гидроксильная группа необходима для продолжения удлинения цепи.
Какова типичная концентрация dNTP в ПЦР??
Стандартная концентрация dNTP в ПЦР обычно составляет 200 мкМ каждого dNTP. Это обеспечивает оптимальное соотношение dNTP к матрицам ДНК для эффективной амплификации..
Слишком низкий уровень dNTP может привести к неспецифической амплификации и недостаточному выходу.. Слишком высокое значение может снизить точность и увеличить количество неспецифических продуктов..
200 мкМ на dNTP, на общую сумму 800 мкМ дНТФ, подходит для большинства задач ПЦР. При необходимости для оптимизации реакции можно использовать больше или меньше..
Для длинных ПЦР, более высокая концентрация dNTP (500-1000 мкМ) может улучшить выход при амплификации более длинных мишеней ДНК.
Важно, чтобы все четыре дНТФ присутствовали в равных концентрациях.. Несбалансированное соотношение может затруднить реакцию..
Заключение
dNTP — это строительные блоки нуклеотидов, которые позволяют проводить ПЦР-амплификацию.. Эти компоненты включают dATP, дТТП, dCTP, и дГТФ.
В каждом цикле ПЦР, dNTP встраиваются Taq-полимеразой в новые цепи ДНК, комплементарные нитям матрицы.. Это обеспечивает экспоненциальное удвоение целевой области ДНК..
dNTP являются важными реагентами для ПЦР.. Без дНТФ, ДНК-полимераза не может синтезировать новые копии целевой последовательности.. Амплификация полностью зависит от присутствия всех четырех дНТФ..
Понимание роли dNTP помогает нам понять, как с помощью ПЦР удается создавать миллиарды копий сегментов ДНК за считанные часы.. Предоставляя основные субстраты для репликации ДНК., dNTP лежат в основе этого незаменимого метода молекулярной биологии..
