Что такое ПЦР-SSCP? Приложения и полное руководство

С развитием методов молекулярной биологии, постоянно появлялись различные методы обнаружения генных структур и мутаций.. Особенно после появления ПЦР технология, различные методы обнаружения генов в сочетании с ПЦР еще больше способствовали развитию исследований генов.. Такие методы, как прямое секвенирование асимметричных продуктов ПЦР., рибонуклеазное расщепление (РНКаза), и анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) стали мощными инструментами для анализа генов. Однако, эти методы относительно сложны в использовании, имеют существенные ограничения, или требуют высоких экспериментальных условий, что делает их непригодными для общеклинических лабораторий.

Представлен в 1989, ПЦР-SSCP (Одноцепочечный конформационный полиморфизм) постоянно совершенствуется и совершенствуется, сделать это проще, Быстрее, и более чувствительный метод обнаружения мутаций генов. Он используется не только для обнаружения точечных мутаций, делеций и вставок коротких последовательностей, но также применяется для количественного определения ДНК., мониторинг перекрестного загрязнения в диагностических экспериментах ПЦР, и расследование источников заражения. Благодаря выдающимся преимуществам SSCP, он широко применяется в последние годы.

Принципы и характеристики SSCP

• Открытие и основная концепция:
  • Одноцепочечная ДНК (оцДНК) фрагменты демонстрируют сложные пространственные складчатые конформации, поддерживаемые внутримолекулярными взаимодействиями., прежде всего спаривание оснований.
  • Единственное изменение основания может значительно или незначительно изменить пространственную конформацию., что приводит к различным моделям миграции в полиакриламидном геле..
• Механизм разделения:
  • Электрофорез в неденатурирующем полиакриламидном геле (СТРАНИЦА) может четко разделять молекулы оцДНК разной конформации из-за различных уровней препятствий в геле.
• SSCP-анализ:
  • Названный одноцепочечный конформационный полиморфизм (ССКП) японский исследователь Орита и его коллеги.
  • Применяется для обнаружения генных мутаций в продуктах, амплифицированных ПЦР., повышение простоты и чувствительности.
• Основной процесс:
  1. ПЦР-амплификация: Усилить целевую ДНК.
  2. Денатурация и ренатурация: Денатурируйте специфические продукты ПЦР и быстро ренатурируйте их с образованием одноцепочечных молекул ДНК со специфическими пространственными структурами..
  3. Неденатурирующая СТРАНИЦА: Выполните неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле на соответствующем количестве одноцепочечной ДНК..
  4. Обнаружение: Анализируйте результаты с помощью рентгенауторадиографии., серебряное окрашивание, или окрашивание бромистым этидием.
• Интерпретация:
  • Изменение скорости миграции оцДНК по сравнению с нормальным контролем свидетельствует об изменении конформации., предполагая базовую мутацию в этом фрагменте ДНК.
• Преимущества:
  • Простой, быстрый, и чувствительный метод.
  • Не требует специального оборудования.
  • Подходит для клинических лабораторий..
• Ограничения:
  • Обнаруживает только мутации; необходимо дальнейшее секвенирование, чтобы точно определить точное положение и тип мутации..
  • Требуются строгие условия электрофореза.
  • Возможны ложноотрицательные результаты, если точковые мутации существенно не изменяют конформацию оцДНК или если мешают другие условия..
• Эффективность обнаружения:
  • Несмотря на ограничения, SSCP может похвастаться высоким уровнем обнаружения по сравнению с другими методами..
  • Способен идентифицировать неизвестные базовые мутации внутри целевого фрагмента ДНК..
  • Такао продемонстрировал, что SSCP может обнаруживать 90% одноосновательных мутаций во фрагментах ДНК короче 300 б.п..
• Дальнейшие применения:
  • SSCP может отделять мутантную оцДНК с разной скоростью миграции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле..
  • Позволяет проводить дальнейшую очистку и идентификацию мутантных фрагментов ДНК на уровне последовательности..

Развитие и улучшение SSCP

• Начальная разработка:
  • Изначально, SSCP включал включение изотопов в продукты ПЦР-амплификации., и результаты были отображены с помощью авторадиографии. Это создало проблемы для широкого внедрения.
• Упрощение:
  • Сочетание окрашивания ДНК серебром с ПЦР-SSCP., особенно применение прямого окрашивания бромистым этидием, значительно упростил метод.
• Недавние примечательные улучшения:
  • Анализ РНК-SSCP:
    • Основной принцип: РНК имеет более сложные вторичные и третичные конформации., что делает его очень чувствительным к одноосновным мутациям, тем самым увеличивая уровень обнаружения.
    • Скорость обнаружения мутаций может превышать 90%.
    • РНК менее склонна к образованию двойных цепей., что позволяет использовать большее количество в электрофорезе, что полезно для окрашивания бромистым этидием.
    • Однако, этот метод добавляет этап обратной транскрипции и требует более длинных праймеров, содержащих последовательности промотора РНК-полимеразы., возрастающая сложность.
• Сочетание SSCP с другими методами обнаружения мутаций:
  • Гетеродуплексный анализ (Это):
    • Значительно повышает уровень обнаружения в сочетании с SSCP..
    • Включает гибридизацию зонда с целевой оцДНК или РНК.. Гибридные цепи, содержащие несовпадающую пару оснований, можно отделить от полностью комплементарных гибридных цепей посредством электрофореза в неденатурирующем геле PAG..
    • Выполнение как SSCP, так и Het-анализа одной и той же целевой последовательности может обеспечить почти 100% уровень обнаружения точковых мутаций, сохраняя при этом экспериментальную простоту.

Процедура ПЦР-SSCP

Приготовление геля на основе длины фрагмента ДНК

Для фрагментов ДНК короче 1Кб, Концентрацию полиакриламидного геля выбирайте следующим образом:

• Длина фрагмента ДНК (б.п.): % Концентрация акриламида
  • 1Кб–700б: 3.5%
  • 700б–500б: 5%
  • 500б–200б: 8%
  • 200б: 12%

Подготовка к SSCP

• ПЦР-амплификация: Усиливайте конкретный продукт с минимальным размытием (подтверждено электрофорезом в агарозном геле).

1. Приготовление полиакриламидного геля (ПАГ)

• Приготовьте раствор геля исходя из необходимой концентрации из таблицы выше..
• Вставьте расческу в форму для геля..
• Вылейте гелевый раствор с одного конца расчески., наклон формы к концу заливки, когда гель достигает зубцов расчески, чтобы предотвратить образование пузырьков.
• Дайте гелю затвердеть при комнатной температуре в течение 1 час.
• Снимите расческу и добавьте 1×TBE буфер поверх геля, чтобы покрыть его..

2. Электрофорез

1. Брать 10 мкл продукта ПЦР.
2. Добавлять 10 мкл денатурирующего агента (95% формамид, 10 ммоль/л ЭДТА, 0.02% бромфеноловый синий).
3. Добавлять 30 мкл минерального масла.
4. Варить в течение 5 минуты, затем немедленно поместите в ледяную баню минимум на 2 минуты.
5. Загрузите всю водную фазу в гель..
6. Провести электрофорез при 10-15°С.:
   • Начните с 300 В для 5 минуты.
   • Продолжайте с 120 В для 8 часы.
7. После электрофореза, окрасить гель в буфере 1×TBE, содержащем 0.5 мкг/мл бромистого этидия для 30-45 минуты.
8. Наблюдайте под УФ-светом или переходите к окрашиванию серебром..

3. Серебряное окрашивание

1. Дважды промойте ПАГ деионизированной водой..
2. Фиксируют гель в растворе 10% этанол и 0.5% уксусная кислота для 6 минуты.
3. Дважды промыть деионизированной водой..
4. Погрузиться в 0.2% нитрат серебра (AgNO3) решение для 10 минуты.
5. Стирать 3-5 раз с деионизированной водой.
6. Разработать в решении 1.5% гидроксид натрия (NaOH) и 0.4% формальдегид для 7 минуты.
7. Остановить разработку с помощью 0.75% карбонат натрия (NaCO3).

Приложения SSCP

Поскольку Орита и его коллеги использовали SSCP для анализа полиморфизма ДНК человека., метод широко применяется в различных областях, включая выявление генных мутаций, связанных с раком и наследственными заболеваниями, а также при типировании вирусов и мониторинге заражения.

Обнаружение мутации гена рака

• Мутации, связанные с опухолью:
  • SSCP широко используется для обнаружения мутаций в генах, связанных с различными видами рака, такими как астроцитома., опухоли головного мозга, мелкоклеточный рак легких, рак желудка, и колоректальный рак.
  • Его применяли для обнаружения мутаций гена P53 в этих опухолях и мутаций гена ras при раке легких..
• Успешные приложения:
  • Недавно, Сугано и др.. успешно использовал окрашенный серебром SSCP для обнаружения мутации в положении 12 гена c-Ki-ras2, завершение процесса электрофореза и окрашивания в течение 2.5 часы.

Исследования наследственных заболеваний

• SSCP используется при изучении генов, участвующих в наследственных заболеваниях, таких как:
  • Муковисцидоз: Обнаружение мутаций в гене CFTR.
  • Тип нейрофиброматоза 1: Анализ генных мутаций.
  • Семейный аденоматозный полипоз: Генные исследования, связанные с этим заболеванием.
• РНК-SSCP против. ДНК-SSCP:
  • Шаркар и др.. использовали RNA-SSCP для обнаружения последовательностей генов в 28 больные гемофилией В.
  • Сравнение с DNA-SSCP и прямым секвенированием генов выявило 20 базовые мутации в гене фактора IX размером 2,6 т.п.н., с обнаружением РНК-SSCP 70% этих мутаций по сравнению с 35% обнаружен с помощью DNA-SSCP, демонстрируя более высокую чувствительность RNA-SSCP.

Типирование вирусов и мониторинг заражения

• Типирование вирусов:
  • SSCP используется для типирования вирусов и мониторинга заражения в экспериментах ПЦР..
  • ЯП использовал вложенную ПЦР для выявления образцов ВГВ из разных регионов, с последующим анализом SSCP, которые выявили отдельные шаблоны SSCP для каждого образца., указывая на региональные различия в ДНК HBV и исключая возможность перекрестного заражения..
• Мониторинг загрязнения:
  • SSCP служит надежным методом обеспечения точности результатов ПЦР-диагностики..

Исследования передачи патогенов

• SSCP используется для изучения путей передачи патогенов..

Количественный анализ ДНК

• Анализ клеток рака молочной железы:
  • ССКП, в сочетании с конкурентной ПЦР, использовался для количественного анализа мутантных генов P53 в клетках рака молочной железы..
  • Преимущество метода заключается в использовании внутренних стандартов, отличающихся от целевой ДНК всего одним основанием., обеспечение идентичных условий амплификации и, следовательно, более точное количественное определение ДНК.

Меры предосторожности для SSCP

SSCP – это быстрый, простой, и чувствительный метод обнаружения генных мутаций. Для достижения оптимальных результатов, следует соблюдать следующие меры предосторожности:

Повторяемость:

• Основными факторами, влияющими на повторяемость SSCP, являются напряжение электрофореза и температура.. Сохранение этих условий постоянными обеспечивает хорошую повторяемость шаблонов SSCP..
• В целом, Паттерны SSCP показывают две одноцепочечные полосы ДНК., но иногда может появиться только одна или более трех полос из-за схожих пространственных конформаций между двумя одноцепочечными молекулами ДНК.. Наличие более трех полос может указывать на смесь фрагментов ДНК дикого типа и мутантных..

Влияние длины последовательности целевой ДНК:

• SSCP более эффективен при обнаружении точечных мутаций в более коротких последовательностях ДНК или РНК, чем в более длинных.. Это может быть связано с тем, что одноосновные изменения в более длинных молекулах оказывают меньшее влияние на поддержание пространственной конформации..
• Некоторые исследователи полагают, что для цепей ДНК короче 400 б.п., длина не влияет на эффективность SSCP. Тщательный выбор условий эксперимента позволяет достичь уровня обнаружения, превышающего 90% для точковых мутаций в 354 фрагменты ДНК п.н..

Напряжение и температура электрофореза:

• Для поддержания стабильных пространственных конформаций одноцепочечной ДНК., SSCP следует проводить при более низких температурах. (обычно от 4°C до 15°C). Высокое напряжение в начале (250В) для 5 минут помогает первоначально разделить одноцепочечную ДНК различной конформации без значительного повышения температуры геля.. За этим должно последовать понижение напряжения. (около 100 В) для дальнейшего разделения прядей.
• Точное напряжение для электрофореза следует определять исходя из конкретных условий эксперимента..

Влияние положения точечной мутации:

• Положение точечной мутации в ДНК или РНК влияет на скорость обнаружения SSCP в зависимости от ее роли в поддержании пространственной конформации., а не его линейное положение в цепи.
• Мутации в центральной области ДНК обычно легче обнаружить по сравнению с мутациями на концах..
• Однако, даже мутации в центральной области могут остаться незамеченными, если они существенно не изменяют пространственную конформацию.. Например, Исследование Уайта показало, что только 2 из 9 обнаружены образцы с точечными мутациями в петле шпилечной структуры, что указывает на уровень обнаружения 22%.

Интерпретация результатов SSCP:

• SSCP разделяет одноцепочечную ДНК на основе пространственной конформации, а не молекулярной массы или заряда.. Иногда, скорости миграции нормальных и мутантных цепей очень близки, из-за чего их трудно различить.
• Обычно, длины электрофореза 16-18 см необходимы для точного определения результатов на основе предела обнаружения, что представляет собой наименьшую различимую разницу в расстоянии электрофореза между мутантными и нормальными фрагментами ДНК..
• Если расстояние превышает предел обнаружения (например, 3мм), указана мутация. Меньшее расстояние предполагает отсутствие изменений.. Установка низкого предела обнаружения может привести к ложным срабатываниям..
• Другие условия, например, количество загруженного ПЦР-продукта, степень сшивки ПАГ, и концентрация геля, следует выбирать на основе конкретных экспериментальных требований.

Подробности ПЦР-SSCP по шагам

Базовые приготовления

1. ПЦР-амплификация и обнаружение:
   • Выполните ПЦР-амплификацию с использованием соответствующих праймеров и выберите подходящую температуру отжига..
   • Обнаружьте продукты амплификации, запустив их на 2-2.5% агарозный гель методом горизонтального электрофореза. Нагрузка 3-5 мкл продукта ПЦР.
   • Оптимальная концентрация продукта ПЦР должна составлять около 10 нг/мкл.
2. Смешивание продукта ПЦР с денатурирующим буфером:
   • Добавлять 5 мкл буфера для образцов SSCP (денатурирующий буфер, то же, что и буфер секвенирования в “Молекулярное клонирование”) на дно чистой пробирки для ПЦР.
   • Добавьте продукт амплификации ПЦР в центр буфера.. Отрегулируйте количество в зависимости от видимости полосы на агарозном геле.:
     • Если группа яркая, добавлять 1 мкл.
     • Если результат отличный, добавлять 0.5 мкл.
     • Если группа не очень ясна, добавлять 1.5, 2, или 3 мкл соответственно.
   • Пропорционально увеличьте объем буфера для образцов., например, для 3 мкл продукта ПЦР, добавлять 8 мкл буфера для лучшей денатурации.
3. Денатурация продукта ПЦР:
   • Центрифугируйте пробирку, чтобы сконцентрировать пробу внизу..
   • Денатурируйте образец при 95°C для 10 минут с помощью ПЦР-машина, затем немедленно поместите ПЦР-продукт на лед для 5 минут для предотвращения ренатурации.

   Примечание: Шаги 3 и 4 можно выполнить после четвертого этапа приготовления геля, ожидая его затвердевания..

Приготовление геля

1. Подготовка стеклянных пластин:
   • Промойте каждую пару стеклянных пластин водопроводной водой, а затем ddH2O..
   • Высушите стеклянные пластины впитывающей бумагой, а затем протрите безводным этанолом..
   • Дайте этанолу испариться в течение 2-3 минуты.
   • Соберите стеклянные пластины и поместите их в подставку для литья геля., обеспечение безопасности обеих сторон и дна.
   • Затяните монтажные винты, чтобы пластины оставались ровными.. (Проверьте наличие утечек, используя безводный этанол.)

Большие гели (50% Концентрация глицерина)

Маленькие гели (50% Концентрация глицерина)

Заливка геля

1. Смешивание геля: После приготовления раствора геля по предоставленной рецептуре, тщательно перемешать, чтобы обеспечить однородность.
2. Разливка в стеклянные тарелки: Аккуратно разлейте приготовленный раствор геля по собранным стеклянным пластинам.. Следите за тем, чтобы в процессе заливки не образовывались пузырьки воздуха.. Если наблюдаются пузырьки, осторожно наклоните тарелки, чтобы пузырьки поднялись на поверхность. Легкие постукивания по бокам пластин помогут выпустить пузырьки воздуха..
3. Установка расчески: Как только уровень раствора геля достигнет примерно 0,5 см ниже верхнего края стеклянной пластины., вставьте расческу в гель. Ensure that there are no air bubbles trapped between the comb teeth and the gel surface. If any bubbles are present, remove the comb, release the bubbles, and reinsert the comb carefully.
4. Allowing Gel Polymerization: After inserting the comb, allow the gel to polymerize by placing the plates either flat or at a slight angle (меньше, чем 10 степени) on a level surface for approximately 30 минуты. В течение этого времени, the gel will polymerize and solidify.

Примечание: This is also a suitable time to proceed with the denaturation of PCR samples as described in steps 3 и 4 of the first section.

Загрузка геля

• Placing the Gel:
  • Remove the comb from the gel promptly after polymerization.
  • Ensure even force is applied to maintain the integrity of the wells.
  • Secure the gel plate onto the electrophoresis apparatus with the well side facing inward.
  • Медленно перемещайте гелевую пластину в буфер для электрофореза, чтобы избежать образования больших пузырьков воздуха..
• Предварительный электрофорез:
  • Добавляйте 1 × буфер для электрофореза TBE в верхний резервуар до тех пор, пока уровень жидкости не станет примерно на 1 см выше более короткого края стеклянной пластинки..
  • Убедитесь в отсутствии утечек из верхнего резервуара..
  • Установите напряжение 140–150 В для большого аппарата и 110–120 В для маленького аппарата..
  • Предварительный электрофорез в течение примерно 10 минуты.
• Загрузка образца:
  • Последовательно добавьте подготовленные образцы в лунки геля с помощью микрошприца..
  • Избегайте загрузки образцов в две лунки, ближайшие к краям каждой гелевой пластины..
• Электрофорез:
  • Установите напряжение 140–150 В для большого аппарата и 110–120 В для маленького аппарата..
  • Электрофорез проводят при температуре 10-15°С в течение минимум 10 часы.

Окрашивание

• Фиксация:
  • Удалить гель из аппарата, отметить отправную точку, и погрузить его в 70% этанол для 15 минуты на шейкере.
  • Соберите этанол после фиксации и дважды промойте дистиллированной водой в течение примерно 3 минут на полоскание.
• Окрашивание:
  • Окрашиваем гель в красящем растворе (200мл, содержащий 3.6% NaOH 4,2 мл, 20% AgNO3 3,6мл, нашатырный спирт 2мл) для 30 минуты.
  • Отрегулируйте время окрашивания, если окрашиваете два геля одновременно..
• Разработка:
  • Проявите гель в проявляющем растворе (200мл, содержащий 1% цитрат натрия 1мл, формальдегид 100 мкл) пока полосы не станут отчетливо видны.
  • Промыть три раза дистиллированной водой в течение 3 минут каждая, чтобы остановить развитие.
  • Альтернативно, окрасить гель, погрузив его в 1 × буфер TBE, содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия для 10 минут и визуализируйте в ультрафиолетовом свете.

Формулы

10×Формула ТВЭ:

• База Трис: 108г
• Борная кислота: 55г
• 0.5моль/л ЭДТА (рН 8.0), объем доведен до 1л.

Формула денатурирующего буфера:

• 98% Деионизированный формамид
• 10ммоль/л ЭДТА (рН 8.0)
• 0.025% Ксилолцианол FF
• 0.025% Бромфеноловый синий

Примечания:

1. Воспроизводимость:
   • Поддержание стабильного напряжения и температуры во время электрофореза является основным фактором, влияющим на воспроизводимость SSCP..
   • Обычно, Паттерны SSCP показывают две одноцепочечные полосы ДНК., но иногда может появиться только одна, три и более полос, возможно, из-за наличия сходных трехмерных конформаций между фрагментами ДНК дикого типа и мутантными..
2. Влияние длины последовательности целевой ДНК:
   • SSCP имеет более высокий уровень обнаружения точечных мутаций в короткоцепочечной ДНК или РНК по сравнению с длинноцепочечной ДНК.. Вероятно, это связано с тем, что изменения отдельных оснований в длинноцепочечных молекулах ДНК и РНК оказывают меньшее влияние на поддержание трехмерных конформаций..
   • В случае более коротких цепей ДНК (ниже 400 б.п.), длина ДНК не влияет на эффективность SSCP.
3. Влияние напряжения и температуры электрофореза:
   • Для поддержания стабильной трехмерной конформации одноцепочечной ДНК., SSCP следует проводить при более низкой температуре. (обычно от 4°C до 15°C).
   • Во время электрофореза, чрезмерное напряжение может вызвать повышение температуры. Поэтому, при проведении ССКП в емкости для электрофореза без охлаждающего устройства, более высокое напряжение (250В) следует использовать изначально, с последующим снижением напряжения примерно до 100 В для электрофореза..
4. Интерпретация результатов SSCP:
   • В анализе SSCP, разделение одноцепочечных фрагментов ДНК основано на размере их стерических препятствий, а не на молекулярной массе., таким образом, не может отражать молекулярную массу.
   • Интерпретация результатов должна основываться на пределе обнаружения., который относится к минимальной разнице электрофоретического расстояния между мутантными и нормальными фрагментами ДНК, которые можно различить..
5. Другие соображения:
   • Такие условия, как количество загруженного продукта ПЦР., плотность сшивки полиакриламидного геля, а концентрацию геля следует подбирать и определять исходя из конкретных условий эксперимента..