Рибонуклеаза H, или сокращенно РНКаза H, представляет собой фермент эндорибонуклеазу с загадочной способностью специфически гидролизовать фосфодиэфирные связи цепи РНК, гибридизованной с ДНК.. Хотя его деятельность кажется парадоксальной, РНКаза H играет решающую роль в фундаментальных клеточных процессах, избирательно воздействуя на участки РНК в гибридах РНК-ДНК.. Бурный характер его способности к расщеплению в определенных местах делает его универсальным инструментом в методах молекулярной биологии..
Здесь мы подробно рассмотрим, что делает РНКаза H., как это работает, Ключевые особенности и применение продукта рекомбинантной РНКазы H от NEB, и помочь исследователям выбрать правильный фермент РНКазы H для их нужд..
Какова функция РНКазы H??
Основная функция РНКазы H — расщепление цепи РНК дуплексов РНК-ДНК., оставляя цепь ДНК неповрежденной. Такое целенаправленное расщепление РНК помогает разрешить гибридные пересечения РНК-ДНК, которые могут образовываться во время транзакций ДНК и РНК внутри клеток.. Активность РНКазы H имеет решающее значение для различных метаболических процессов ДНК и РНК, таких как репликация ДНК., транскрипция, и созревание фрагмента Окадзаки.
Он предотвращает сохранение праймеров РНК в ДНК и удаляет транскрипты РНК, гибридизованные с комплементарными матрицами ДНК.. Этот процесс нацеливания и разрушения части РНК, в частности, при защите части ДНК, имеет центральное значение для роли, которую РНКаза H играет в облегчении транзакций нуклеиновых кислот in vivo..
Как работает РНКаза H и какова ее ферментативная активность?
РНКаза H работает, обнаруживая гибридные области РНК-ДНК, а затем точно расщепляя фосфодиэфирные связи между тремя′-гидроксильная группа рибозы РНК и фосфатная группа следующей рибозы РНК в цепи. Катализирует реакцию кислотно-основного гидролиза, не нарушая целостности цепи ДНК..
На молекулярном уровне, РНКаза H распознает соединения РНК-ДНК и прочно связывается со структурой дуплекса.. Затем его активный центр отсекает фосфодиэфирные связи цепи РНК одну за другой, проходя по 3-й линии.′ до 5′ направление. Этот процесс продолжается до тех пор, пока весь сегмент РНК не разрушится, не затрагивая партнерскую ДНК.. Эта целевая ферментативная активность называется активностью РНКазы H и количественно определяется как количество РНКазы H, необходимое для расщепления определенного количества РНК в гибриде РНК-ДНК в течение заданного периода в определенных условиях..
Каковы ключевые особенности и применение продукта РНКазы H от NEB??
New England Biolabs или NEB — ведущий поставщик высококачественных ферментов для приложений молекулярной биологии.. Их рекомбинантная РНКаза H представляет собой усовершенствованный фермент с несколькими преимуществами.. Он поставляется вместе с оптимизированным реакционным буфером для поддержания его активности в широком диапазоне pH и температур.. Как рекомбинантный продукт, обеспечивает согласованность между партиями без примесей.
РНКаза H NEB демонстрирует высокую функцию и специфичность РНКазы H., избирательное переваривание цепи РНК с помощью neb РНКазы H гибрида РНК-ДНК без нарушения ДНК. Он имеет применение в таких методах, как обратная транскрипция. ПЦР (ОТ-ПЦР) где он помогает расщеплять гибриды РНК-кДНК, образующиеся во время синтеза первой цепи под действием активности РНКазы H.. Термостабильная РНКаза H NEB также доступна для применения при более высоких температурах при использовании нуклеиновых кислот..
Какие условия и буферы необходимы для оптимальной активности РНКазы H?
Для оптимальной активности РНКазы H, Рекомбинантная РНКаза H NEB требует особых условий реакции и буферных компонентов.. Поставляемый реакционный буфер 10X RNase H состоит из Трис-HCl, КСl, MgCl2, и DTT для поддержания правильной ионной силы и pH для максимальной ферментативной функции.. РНКаза H лучше всего работает при pH 8.3 и 37°С. Включение ионов Mg2+ в буфер важно, поскольку функция РНКазы H зависит от каталитической активности Mg2+..
ДТТ действует как восстановитель, защищая фермент от окисления.. Реакции проводятся путем объединения фермента РНКазы H., субстрат РНК-ДНК-гибрид и буфер в концентрации 1X. Правильная буферизация повышает стабильность РНКазы H и последовательное расщепление фрагмента РНК из гибридов..
На какие типы нуклеиновых кислот действует и не действует РНКаза H??
Хотя РНКаза H избирательно воздействует на РНК в дуплексах РНК-ДНК,, он не переваривает одноцепочечную РНК или ДНК. Он также не расщепляет двухцепочечную ДНК.. Его точная ферментативная активность РНКазы H особенно характерна для РНК, гибридизованной с цепью ДНК.. Фермент эффективно идентифицирует и разрушает часть РНК гетеродуплекса РНК-ДНК, не нарушая целостности и непрерывности ДНК-партнера..
РНКаза H практически не проявляет активности в отношении отдельных цепей нуклеиновой кислоты или двухцепочечных молекул ДНК, у которых отсутствует соединение РНК-ДНК.. Эта строгая субстратная специфичность обеспечивает контролируемое и целенаправленное удаление РНК из гибридных комплексов, необходимых для различных транзакций нуклеиновых кислот..
Каков источник и метод производства рекомбинантной РНКазы H NEB??
РНКаза H NEB производится рекомбинантным способом в E.coli, что обеспечивает высокую чистоту и согласованность между партиями.. Источником клонирования является нативный ген РНКазы H, выделенный из Escherichia coli, который кодирует эндогенную РНКазу H, присутствующую в клетках E.coli.. Этот ген встраивают в вектор экспрессии и амплифицируют в непатогенном штамме E.coli.. Индукция вектора приводит к высокому уровню экспрессии белка рекомбинантной РНКазы H..
Сверхэкспрессированную РНКазу H затем очищают с помощью колоночной хроматографии для получения высокоочищенного препарата, свободного от примесей нуклеаз.. Проверки контроля качества подтверждают, что рекомбинантный фермент демонстрирует подлинную активность и специфичность РНКазы H.. Конечный продукт поставляется вместе с реакционным буфером, оптимизированным для его функции..
Как РНКаза H NEB используется в методах молекулярной биологии, таких как RT-PCR?
Одним из важных применений РНКазы H является ПЦР с обратной транскрипцией. (ОТ-ПЦР) где это помогает разрешить гибриды РНК-кДНК, образовавшиеся во время первой цепи синтез кДНК. В ОТ-ПЦР, матрица РНК сначала подвергается обратной транскрипции на комплементарную ей ДНК (кДНК) с использованием ДНК-праймера. В результате этого процесса образуются гибридные дуплексы РНК-кДНК.. Затем рекомбинантная РНКаза H NEB используется для избирательного разрушения цепи РНК этих гибридов, оставляя только одноцепочечную кДНК..
Разрушение исходной матрицы РНК не позволяет ей мешать последующей ПЦР-амплификации.. Эффективно расщепляя РНК, РНКаза H обеспечивает экспоненциальную амплификацию только кДНК для обнаружения и анализа специфических транскриптов РНК.. Его точность и эффективность в деградации гибридизированной РНК в оптимизированных условиях повышают качество и чувствительность анализа RT-PCR..
Каковы температурные диапазоны и точки тепловой инактивации РНКазы H NEB??
Обычная РНКаза H из NEB активна при температуре 25–42°C с максимальной активностью около 37°C.. Он необратимо инактивируется при нагревании до 65°С. 20 минуты. Для применений, требующих более высоких температур, NEB также предлагает термостабильный вариант РНКазы H.. Эта термостойкая РНКаза H полностью функциональна при температуре 25–80°C с увеличением активности при повышенных температурах до 50–60°C..
Остается стабильным даже после нагревания до 80°C., что делает его пригодным для требовательных методов нуклеиновых кислот, работающих в условиях более высоких температурных циклов.. Термостабильная РНКаза H может выдерживать этапы термической инактивации и обработку протеиназой K., предлагая большую гибкость. Обе версии РНКазы H поставляются вместе с обширной документацией по продукту для эффективного использования..
Как выбрать между обычной и термостабильной РНКазой H от NEB?
Выбор между обычной и термостабильной РНКазой H зависит от температурных требований и рабочего процесса.. Обычная РНКаза H является экономически эффективным вариантом, если реакции можно проводить при температуре ниже 42°C., как в стандартной RT-PCR. Термостабильная РНКаза H дает преимущества для методов, включающих повышенные тепловые циклы от 50 до 80 ° C, таких как вложенная ПЦР., изотермическая амплификация, опосредованная петлей обратной транскрипции (РТ-ЛАМПА), и другие приложения для термического профилирования. Его термостойкие свойства предотвращают потерю активности во время нескольких этапов нагрева..
Исследователи, выполняющие высокотемпературный анализ нуклеиновых кислот, получают выгоду от расширенного функционального диапазона и долговечности термостабильной РНКазы H.. Общий, Рекомбинантные ферменты РНКазы H NEB представляют собой надежные инструменты для контролируемого расщепления РНК в комплексах РНК-ДНК для широкого спектра применений..
Краткое содержание
В заключение, этот пост в блоге призван всесторонне объяснить, что такое РНКаза H., как это конкретно работает, Ключевые характеристики продуктов рекомбинантной РНКазы H NEB, оптимальные условия реакции, приложения в таких методах, как RT-PCR, и соображения по выбору правильного фермента РНКазы H.
Углубляясь в его интригующую ферментативную активность и способности целевого расщепления РНК простым, но подробным способом., Я надеюсь, что это поможет пролить больше света на универсальную РНКазу H и ее важную роль в транзакциях нуклеиновых кислот.. Пожалуйста, дайте мне знать, если какой-либо другой аспект требует дополнительных разъяснений..
