RNA รวมของพืชที่ซับซ้อน (บวก) ชุดสกัดจำนวนเล็กน้อย

1. ส่วนประกอบของชุดรีเอเจนต์

2. พื้นที่จัดเก็บ

ชุดรีเอเจนต์นี้สามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องได้ (15-25℃) ในสภาพแวดล้อมที่แห้งและมีความเสถียรสำหรับ 12 เดือน.

3. คำแนะนำในการใช้ชุดรีเอเจนต์

3.1 ชุดนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยอณูชีววิทยา และไม่ควรใช้สำหรับการวินิจฉัยหรือการรักษาโรค.

3.2 ส่วนประกอบบางอย่างในชุดมีสารระคายเคือง; ขอแนะนำให้ใช้ความระมัดระวังที่จำเป็น (เช่น การสวมชุดป้องกันและแว่นตา).

3.3 การใช้ชุดอุปกรณ์นี้ต้องใช้อุปกรณ์เพิ่มเติม เช่น เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง, อ่างอาบน้ำ (อาบน้ำโลหะ), เครื่องผสมน้ำวน, เอทานอลปราศจากน้ำ, ไนโตรเจนเหลว, คลอโรฟอร์ม, น้ำปราศจากไอออนฆ่าเชื้อ, และท่ออีพี.

4. ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับชุดรีเอเจนต์

ชุดรีเอเจนต์การทำให้บริสุทธิ์ RNA นี้ทำให้ RNA ทั้งหมดของพืชที่มีโพลีแซ็กคาไรด์บริสุทธิ์ได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ, ไขมัน, โพลีฟีนอล, และส่วนประกอบอื่นๆ. เหมาะสำหรับเนื้อเยื่อพืชที่ซับซ้อนที่สุด. โดยทั่วไปแล้ว, เนื้อเยื่อพืชที่อุดมด้วยไขมันประกอบด้วยสารประกอบไขมันในปริมาณสูง, ซึ่งส่งผลต่อประสิทธิภาพการสกัด RNA อย่างมีนัยสำคัญ. ชุดนี้ใช้คอลัมน์กำจัดสารยับยั้งพิเศษเพื่อกำจัดไขมันจากตัวอย่างพืชอย่างมีประสิทธิภาพ, พร้อมทั้งขจัดการปนเปื้อนของ DNA. หากการทดลองมีความไวต่อดีเอ็นเอ, ขอแนะนำให้ใช้ไพรเมอร์ช่วงอินตรอนสำหรับการทดลองขั้นปลายน้ำ.

ชุดรีเอเจนต์การทำให้บริสุทธิ์อย่างรวดเร็ว RNA สามารถสกัด RNA ทั้งหมดของพืชได้ (รวมถึงนิวเคลียร์ RNA และไซโตพลาสซึม RNA) ภายใน 1 ชั่วโมง. RNA ที่แยกออกมาสามารถนำมาใช้กับ RT ได้โดยตรง-พีซีอาร์, การซับภาคเหนือ, ฯลฯ. กระบวนการทำให้บริสุทธิ์ทั้งหมดไม่จำเป็นต้องใช้รีเอเจนต์ที่เป็นพิษ เช่น คลอโรฟอร์ม, ทำให้ชุดรีเอเจนต์การทำให้บริสุทธิ์ RNA เหมาะสำหรับตัวอย่างอื่นๆ มากมาย.

5. หลักและวิธีการทดลอง

6. กระบวนการสกัด

ข้อควรระวังก่อนเริ่มการทดลอง:

ก. ล้าง กันชน 1: ก่อนใช้งาน, เติมเอทานอลสัมบูรณ์ตามจำนวนที่ระบุบนฉลากขวดรีเอเจนต์. ตรวจสอบฉลากเพื่อยืนยันการเติมเอทานอลสัมบูรณ์.

บี. บัฟเฟอร์การชะล้างคือ 0.1x โซลูชัน TE ด้วยปริมาณ EDTA ที่น้อยที่สุด. หาก EDTA อาจส่งผลต่อการทดลองครั้งต่อไป, ขอแนะนำให้เปลี่ยนบัฟเฟอร์การชะล้างด้วยน้ำปราศจากไอออนที่ปราศจากไอออน.

ค. บัฟเฟอร์การสกัด RNA I มีฟีนอลจำนวนเล็กน้อย, ซึ่งอาจเกิดการตกตะกอน. ก่อนใช้งาน, ผสมให้เข้ากันโดยอุ่นในอ่างน้ำ; หลังการใช้งาน, เก็บให้ห่างจากแสง.

1. การประมวลผลตัวอย่าง:

ก. การรวบรวมและจัดเก็บวัสดุ:

หากวัตถุดิบที่รวบรวมใหม่ไม่สามารถนำมาใช้ได้ทันที, วางไว้ในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ -80 ℃.

บี. เมื่อใดก็ตามที่เป็นไปได้, เก็บวัสดุสดเนื่องจากมีโพลีแซ็กคาไรด์และโพลีฟีนอลน้อยลง.

2. บดประมาณ 100 ตัวอย่างสด มก. หรือไม่เกิน 20 มก. ของวัสดุแห้งพร้อมไนโตรเจนเหลว.

3. เพิ่ม 600μlของบัฟเฟอร์การสกัด RNA I, ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีก้อนเนื้อเยื่อในตัวอย่างภาคพื้นดิน. การจับตัวเป็นก้อนของเนื้อเยื่อนั้นแยกได้ยากและสามารถลดผลผลิต RNA ได้.

4. กระแสน้ำวนสำหรับ 30 ส.

5. โอนไลซีนไปที่ หนึ่งคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์การกำจัดสารยับยั้ง, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาที.

(บันทึก: วัสดุจากพืชที่มีไขมันมากอาจมีสารประกอบไขมันจำนวนมากในขั้นตอนนี้, ซึ่งอาจส่งผลต่อการสกัด RNA. กำจัดสารเหล่านี้ในระหว่างขั้นตอนนี้. หากสารบัฟเฟอร์ตกค้างยังคงอยู่ในคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์เพื่อกำจัดตัวยับยั้งในระหว่างการปั่นแยก, ยืดเวลาการปั่นแยกออกไปอย่างเหมาะสม.)

6. ถ่ายโอนส่วนลอยที่ได้รับไปยังคอลัมน์กำจัด DNA, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 วินาที, และรวบรวมสารกรอง (บันทึก: RNA มีอยู่ในตัวกรอง).
7. เพิ่ม 250ไมโครลิตรของเอทานอลสัมบูรณ์, ผสมโดยการปิเปต. หากมีฝนตกเล็กน้อย, มันไม่ส่งผลกระทบต่อการทดลองครั้งต่อไป. ถ่ายโอนของเหลวไปยังคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 วินาที, ละทิ้งการไหลผ่าน.
8. เพิ่ม 700μl ของบัฟเฟอร์การกำจัดตัวยับยั้ง, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 วินาที, ละทิ้งการไหลผ่าน.
9. เพิ่ม 700ไมโครลิตรของ ล้างกันชน 1 ไปยังคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 วินาที, ละทิ้งการไหลผ่าน.
10. เพิ่ม 500ไมโครลิตรของ ล้าง กันชน 1 ไปยังคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 3 นาที, ละทิ้งการไหลผ่าน.
11. วางคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA ลงในหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงขนาด 1.5 มล. ใหม่, ผึ่งเมมเบรนให้แห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 นาที.

(บันทึก: ยืนยันว่าได้เติมเอทานอลสัมบูรณ์ลงไปแล้ว ล้าง กันชน 1. การมีอยู่ของเอทานอลมีผลกระทบร้ายแรงต่อการทดลองครั้งต่อไป, ดังนั้นการทำให้เมมเบรนแห้งจึงเป็นสิ่งสำคัญ. หลังจากการปั่นแยก, ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีเอทานอลอยู่ก่อนทำการชะล้าง, แล้วทิ้งขยะและท่อรวบรวม. หลังจากซักด้วยบัฟเฟอร์การซักแล้ว 1, เมมเบรนบนคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA ควรมีสีเพียงเล็กน้อยเท่านั้น. หลังจากการปั่นแยก, ค่อยๆ ถอดคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA ออก, ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่ได้สัมผัสกับท่อรวบรวมเพื่อหลีกเลี่ยงการรบกวนของเอทานอล.)

12. ปิเปตทางอากาศ 50-100μl ของบัฟเฟอร์การชะล้าง ลงบนเมมเบรน, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, และรวบรวมสารละลาย RNA.

(บันทึก: การชะล้าง RNA ด้วย 50 บัฟเฟอร์การชะ μl สามารถเพิ่มความเข้มข้นของ RNA แต่ลดผลผลิต RNA ทั้งหมด.)