Mitochondrial Genome DNA Extraction Kit (for Animals)

1. ส่วนประกอบของชุดรีเอเจนต์

2. พื้นที่จัดเก็บ

This kit can be stored at room temperature (15-25℃) in dry conditions for 12 เดือน. The DNA extraction purification columns can be stored in a cool and dry environment for 1 ปี. Proteinase K and อาร์เนส เอ contain preservatives, จึงสามารถขนส่งได้ที่อุณหภูมิห้อง, แต่สำหรับการจัดเก็บระยะยาว, they should be kept at -20℃. Reagent buffers E1/E2 should be stored at 4℃.

3. คำแนะนำในการใช้ชุดรีเอเจนต์

3.1 This reagent kit is intended for molecular biology research and should not be used for disease diagnosis or treatment.

3.2 Some components in the reagent kit contain irritants. Protective measures such as wearing protective clothing and goggles are recommended.

3.3 During the usage of this reagent kit, a high-speed centrifuge, อ่างอาบน้ำ (อาบน้ำโลหะ), เครื่องผสมน้ำวน, เอทานอลปราศจากน้ำ, พีบีเอส,น้ำปราศจากไอออนฆ่าเชื้อ, and EP tubes need to be prepared by the user.

4. ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับชุดรีเอเจนต์

The Mitochondrial Genome การทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ Kit offers a rapid and efficient method for purifying DNA from animal tissues and cell cultures. Widely used in both animal tissue and cell cultures, this kit consists of two parts. The first part involves rapid collection of high-purity animal tissue and cell mitochondria using gradient centrifugation. The second part utilizes a column-based method for quick extraction of mitochondrial DNA without the need for toxic reagents like phenol-chloroform. The extracted DNA can be directly used for พีซีอาร์, การซับใต้, และแอพพลิเคชั่นอื่น ๆ.

5. หลักและวิธีการทดลอง

6. กระบวนการสกัด

Before Starting the Experiment:

ก. Reagent Buffers B and C tend to precipitate under low-temperature conditions. It is recommended to heat them at 65°C for 5 minutes until the precipitates dissolve before normal use.

บี. Before using ล้างบัฟเฟอร์ 1, follow the instructions on the reagent bottle label to add the specified amount of absolute ethanol. แล้ว, check the label to indicate that ethanol has been added.

ค. บัฟเฟอร์การชะล้างคือ 0.1x โซลูชัน TE with minimal EDTA content. หาก EDTA ส่งผลต่อการทดลองครั้งต่อไป, it is suggested to use sterile deionized water instead of the elution buffer.

ดี. Mitochondrial Collection: The first part involves collecting mitochondria, where centrifugation is crucial. During the extraction process, centrifugal force is expressed in ‘g’. Most centrifuges have a rpm/g conversion mode, so please pay attention.

1. การประมวลผลตัวอย่าง:

ก. Take cell culture medium, centrifuge at 1000g for 1 minute to collect cells. Try to remove as much supernatant as possible. เพิ่ม 1ml PBS (PH7.9) to wash the cells, centrifuge to collect them, จากนั้นเพิ่ม 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 to fully suspend the cells and homogenize rapidly 5-10 ครั้ง.

บี. Cut tissues not exceeding 200 mg into small pieces, เพิ่ม 1ml PBS (PH7.9) for washing and absorb excess liquid with filter paper. เพิ่ม 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 and grind in an ice bath about 20 ครั้ง.

2. Transfer the liquid mixture to a centrifuge tube, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 4℃, 1000กรัมสำหรับ 5 นาที, and transfer the supernatant to a new centrifuge tube.

(บันทึก: There may be precipitates in this transferred supernatant. For obtaining high-purity mitochondria, it is recommended to centrifuge and transfer the supernatant during step 2.)

3. Transfer the supernatant obtained in the previous step to a new centrifuge tube, centrifuge at 12000g, 4℃ สำหรับ 10 นาที, and discard the supernatant.

(บันทึก: After this step, mitochondria will precipitate at the bottom of the tube.)

4. Recommended step: เพิ่ม 5ml Reagent Buffer E2 to the mitochondrial pellet, resuspend it, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 4℃, 1000กรัมสำหรับ 5 นาที, transfer the supernatant to a new centrifuge tube, then centrifuge at 12000g, 4℃ สำหรับ 10 นาที, ทิ้งส่วนเหนือตะกอน, and obtain high-purity mitochondrial precipitates at the tube bottom.

(บันทึก: Mitochondria collection at this step is complete. You may interrupt the experiment and store mitochondria at -70℃.)

Second Part: Isolation and Purification of Mitochondrial DNA

5. เพิ่ม 280μl of Reagent Buffer B, 10μl ของ RNase A, and 10μl of Proteinase K to the centrifuge tube containing mitochondria. Thoroughly invert to mix, digest at 65℃ สำหรับ 5 นาที.
6. เพิ่ม 300μl of Reagent Buffer C to the lysate and mix well. If a white precipitate appears, it can be left undisturbed; its disappearance will not affect subsequent experiments.
7. เพิ่ม 300ไมโครลิตรของเอทานอลสัมบูรณ์ and mix thoroughly. It may cause precipitation, but it won’t affect subsequent experiments.
8. Transfer the obtained liquid to the DNA extraction purification column (ชุด) (approximately 650~700μl each time). Centrifuge at more than 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะที่รวบรวมไว้, and re-insert the collection tube into the purification column for the next step.
9. Place the DNA extraction purification column (ชุด) into a collection tube, เพิ่ม 300μl ของ Wash Buffer 1, ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะ, and re-insert the DNA extraction purification column (ชุด) ลงในท่อเพื่อขั้นตอนต่อไป.

(บันทึก: Confirm that absolute ethanol has been added to Wash Buffer 1.)

10. เพิ่ม 400μl ของ Wash Buffer 1 to the DNA extraction purification column (ชุด), เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 14,000 รอบต่อนาที (20,000×ก) สำหรับ 2 นาที. Extend centrifugation time appropriately for a drier membrane.
11. Place the DNA extraction purification column (ชุด) in a new centrifuge tube, open the cap, and incubate at 65℃ สำหรับ 2 นาที. Extend this step as needed to evaporate ethanol completely to prevent residual ethanol from affecting downstream experiments.
12. Drip-suspend 50-100μl ของบัฟเฟอร์การชะล้าง ลงบนเมมเบรน, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 2 นาที.

(บันทึก: 1. Eluting DNA with 50μl of Elution Buffer can increase DNA concentration but reduce the total yield; 2. The eluted DNA wash can be reapplied to the DNA extraction purification column for an additional collection at 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 2 minutes to increase DNA yield.)