Small Amount Tissue microRNA Extraction kit

1. ส่วนประกอบของชุดรีเอเจนต์

2. พื้นที่จัดเก็บ

ชุดรีเอเจนต์นี้ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง (15-25℃) in a dry condition and is stable for 12 เดือน.

3. คำแนะนำในการใช้ชุดรีเอเจนต์

3.1 ชุดนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยอณูชีววิทยา และไม่ควรใช้สำหรับการวินิจฉัยหรือการรักษาโรค.

3.2 ส่วนประกอบบางอย่างในชุดมีสารระคายเคือง; ขอแนะนำให้ใช้ความระมัดระวังที่จำเป็น (เช่น การสวมชุดป้องกันและแว่นตา).

3.3 การใช้ชุดอุปกรณ์นี้ต้องใช้อุปกรณ์เพิ่มเติม เช่น เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง, อ่างอาบน้ำ (อาบน้ำโลหะ), เครื่องผสมน้ำวน, เอทานอลปราศจากน้ำ, ไนโตรเจนเหลว, คลอโรฟอร์ม, น้ำปราศจากไอออนฆ่าเชื้อ, และท่ออีพี.

4. ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับชุดรีเอเจนต์

This microRNA purification kit provides a fast and efficient method for purifying microRNA from various tissues, suitable for most species. Tissues exceeding 100 mg can be processed using this RNA purification kit. The kit employs special DNA cleanup column technology to remove genomic DNA and large RNA fragments during the experimental process. โดยทั่วไปแล้ว, additional digestion on DNA columns is not required, preventing microRNA degradation.

The RNA rapid purification kit can extract plant microRNA within 1 ชั่วโมง. The extracted microRNA can be directly used for RT-พีซีอาร์, การซับภาคเหนือ, ฯลฯ. The entire purification process does not require toxic reagents such as phenol-chloroform, making the microRNA purification kit suitable for various other samples.

5. หลักและวิธีการทดลอง

6. กระบวนการสกัด

ข้อควรระวังก่อนเริ่มการทดลอง:

ก. ก่อนใช้งาน, add the specified amount of anhydrous ethanol to ล้าง กันชน 1 ตามฉลากบนขวดรีเอเจนต์, and mark a check on the label to indicate the addition of anhydrous ethanol.

บี. บัฟเฟอร์การชะล้างคือ 0.1x โซลูชัน TE containing a minimal amount of EDTA. If EDTA has an impact on subsequent experiments, it is recommended to use sterile deionized water instead of Elution Buffer.

1. การประมวลผลตัวอย่าง:

ก. Plant or Animal Tissues: Collect fresh tissues whenever possible. For plant and animal tissues, grind with liquid nitrogen, then quickly add 500μl of RNA Extraction Buffer II. Invert and mix thoroughly, avoiding tissue clumps in the lysate to prevent RNA degradation.

บี. Cell Tissues: Collect fresh growing cells in a 1.5 ml centrifuge tube, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, collect cells, เพิ่ม 500μl of RNA Extraction Buffer II, vortex and shake well.

2. ฟักตัวที่56℃ สำหรับ 1-3 นาที. If the sample has a high polysaccharide content, it is advisable to skip this step.

3. กระแสน้ำวนสำหรับ 30 วินาที.

4. ปั่นแยกไลซีนเพื่อ 10 min at 14,000 รอบต่อนาที (20,000×ก).

(บันทึก: Polysaccharides from plant materials may result in sticky substances at this step, which can cut DNA in subsequent steps. กำจัดสารเหล่านี้ในระหว่างขั้นตอนนี้. หลังจากการปั่นแยก, transfer the supernatant to a new การทำให้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์ column.)

5. Add the obtained supernatant to the DNA cleanup column (approximately 650-700μl each time), ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, collect the filtrate (microRNA is in the filtrate at this point).
6. Estimate the volume of the filtrate accurately, เพิ่ม 0.5 times the volume of absolute ethanol. หากมีฝนตกเล็กน้อย, มันไม่ส่งผลกระทบต่อการทดลองครั้งต่อไป. Add the liquid to the RNA purification column, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที.
7. Discard the waste and place the RNA purification column in a collection tube for the next step.
8. เพิ่ม 600μl ของบัฟเฟอร์การกำจัดสารยับยั้ง, ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะ, and place the RNA purification column back into the collection tube for the next step.
9. เพิ่ม 700μl ของ Wash Buffer 1 ไปยังคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 14,000 รอบต่อนาที (20,000×ก) สำหรับ 2 นาที, extend the centrifugation time appropriately to ensure a drier membrane.

(บันทึก: Confirm the addition of absolute ethanol to Wash Buffer 1. The presence of ethanol has a severe impact on subsequent experiments. ดังนั้น, membrane dryness is crucial. หลังจากการปั่นแยก, ensure the absence of ethanol before elution, ทิ้งขยะ, and collect the tube.

After washing with Wash Buffer 1, เมมเบรนบนคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA ควรมีสีเพียงเล็กน้อยเท่านั้น. หลังจากการปั่นแยก, ค่อยๆ ถอดคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA ออก, ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่ได้สัมผัสกับท่อรวบรวมเพื่อหลีกเลี่ยงการรบกวนของเอทานอล.)

10. Place the RNA purification column into a new centrifuge tube, เพิ่ม 100μl ของบัฟเฟอร์การชะล้าง to the membrane, ฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที (15℃ to 25℃), ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที.

(บันทึก: Eluting RNA with 50μl of Elution Buffer can increase RNA concentration but decrease total RNA yield.)

11. ทำซ้ำขั้นตอนก่อนหน้า.

บันทึก: A new centrifuge tube can be used to collect the RNA eluted the second time, or the original collection tube can be used to continue collecting RNA.