Small Amounts of DNA from Novel Plant Genomes Extraction Kit

1. ส่วนประกอบของชุดรีเอเจนต์

2. พื้นที่จัดเก็บ

ชุดนี้ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง (15-25℃) ในที่แห้งและสามารถเก็บไว้ได้ 12 เดือน. คอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์จากการสกัด DNA สามารถเก็บไว้ในสภาพแวดล้อมที่เย็นและแห้งได้นานถึง 1 ปี. RNase A มีสารกันบูดและสามารถขนส่งได้ที่อุณหภูมิห้อง, แต่สำหรับการจัดเก็บระยะยาว, ควรเก็บไว้ที่ -20 ℃.

3. คำแนะนำในการใช้ชุดรีเอเจนต์

3.1 ชุดนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยอณูชีววิทยา และไม่ควรใช้สำหรับการวินิจฉัยหรือการรักษาโรค.

3.2 ส่วนประกอบบางอย่างในชุดมีสารระคายเคือง; ขอแนะนำให้ใช้ความระมัดระวังที่จำเป็น (เช่น การสวมชุดป้องกันและแว่นตา).

3.3 การใช้ชุดอุปกรณ์นี้ต้องใช้อุปกรณ์เพิ่มเติม เช่น เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง, อ่างอาบน้ำ (อาบน้ำโลหะ), เครื่องผสมน้ำวน, เอทานอลปราศจากน้ำ, ไนโตรเจนเหลว, คลอโรฟอร์ม, น้ำปราศจากไอออนฆ่าเชื้อ, และท่ออีพี.

4. ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับชุดรีเอเจนต์

The new plant genome การทำให้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์ kit provides a rapid method for DNA purification. It effectively precipitates DNA with specific reagent buffers II and C, collecting high-purity DNA through adsorption columns.

This kit is widely applicable for isolating samples from plant tissues and fungi, enabling the extraction of total DNA from plants and fungi within 30 นาที. The extraction process doesn’t involve toxic reagents like phenol-chloroform. DNA ที่สกัดออกมาสามารถนำมาใช้โดยตรงสำหรับการทดลองขั้นปลายน้ำ เช่น พีซีอาร์ and Southern blotting.

5. หลักและวิธีการทดลอง：

6. กระบวนการสกัด

ข้อควรระวังก่อนเริ่มการทดลอง:

ก. Reagent Buffer I and Reagent Buffer C tend to precipitate at low temperatures. It is recommended to heat them at 65°C for 5 minutes until the precipitates dissolve before normal usage.

บี. Before using ล้างบัฟเฟอร์ 1, add the specified amount of absolute ethanol as indicated on the reagent bottle label and mark a check (√) on the label to indicate the addition of absolute ethanol.

ค. The Elution Buffer is a 0.1x โซลูชัน TE containing a minimal amount of EDTA. หาก EDTA ส่งผลต่อการทดลองครั้งต่อไป, it is recommended to substitute the Elution Buffer with sterile deionized water.

1. การประมวลผลตัวอย่าง:

ก. การรวบรวมและจัดเก็บวัสดุ

หากวัตถุดิบที่รวบรวมใหม่ไม่สามารถนำมาใช้ได้ทันที, place them in liquid nitrogen for cooling and finally store at -80°C. วัสดุแห้งสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องได้.

บี. If conditions permit, collect fresh materials whenever possible, as fresh materials contain fewer polysaccharides and polyphenols.

ค. เมื่อเก็บเชื้อราจากการเพาะเลี้ยงของเหลว, separate the liquid and collect the fungal cells by centrifugation.

2. Weigh around 100 mg of fresh samples or not exceeding 20 mg of dry material and grind it with liquid nitrogen.

(บันทึก: Different sample amounts may vary; it is advisable to optimize the sample amount through pre-experimental trials.)

3. เพิ่ม 400μl Reagent Buffer I and 10μl RNaseA (10 มก./มล), ensuring there are no clumps in the ground sample. Clumps are difficult to lyse, reducing the DNA yield. อีกด้วย, do not mix Reagent Buffer I and RNaseA before usage.

4. ฟักที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 5 นาที, gently invert the mixture 2-3 ครั้ง. This step is used for cell lysis. If samples are difficult to lyse, extend the incubation time, but not beyond 30 นาที.

5. เพิ่ม 130μl Reagent Buffer II and mix well, then ice-bathe for 5 นาที (this step is used for precipitating polysaccharides and proteins).

6. ปั่นแยกไลซีนเพื่อ 5 นาทีที่ 14,000 รอบต่อนาที (20,000×ก).

(บันทึก: Some plant materials may contain a lot of viscous substances at this step, which can shear DNA in the subsequent steps. ดังนั้น, the ideal state is to remove these substances during this step. หลังจากการปั่นแยก, transfer the supernatant to a new centrifuge tube. If there is a significant amount of flocculent material in the supernatant after centrifugation, it indicates that the initial sample quantity was too large. Consider reducing the initial sample amount.)

7. Carefully transfer the obtained liquid to a new centrifuge tube.

(บันทึก: Approximately 450μl of liquid can be transferred; สำหรับบางชนิด, it may be less than 450μl.)

8. เพิ่มปริมาณที่เท่ากันของ Reagent Buffer C and an equal volume of absolute ethanol to the lysate and mix well.

(ตัวอย่างเช่น: Add 450μl of Reagent Buffer C, then add 450μl of absolute ethanol. If the volume of the lysate is less than 450μl, reduce the amount of Reagent Buffer C proportionally. Adding Reagent Buffer C will cause slight precipitation, but it won’t affect subsequent experiments.)

9. Add the obtained liquid to the DNA extraction purification column (ชุด) (approximately 650-700μl each time), centrifuge at greater than 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะที่รวบรวมไว้, and re-insert the collection tube into the purification column for the next step.

10. ทำซ้ำขั้นตอน 9, add the remaining liquid to the DNA extraction purification column (ชุด), centrifuge at greater than 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, discard waste and the collection tube.

11. Place the DNA extraction purification column (ชุด) into the collection tube, เพิ่ม 300μl ของ Wash Buffer 1,centrifuge at greater than 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, discard waste, and place the DNA extraction purification column (ชุด) back into the tube for the next step.

(บันทึก: Confirm the addition of absolute ethanol in Wash Buffer 1.)

12. เพิ่ม 500μl ของ Wash Buffer 1 to the DNA extraction purification column (ชุด), เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 14,000 รอบต่อนาที (20,000×ก) สำหรับ 2 นาที, extend centrifugation time appropriately to ensure the membrane is adequately dry.

13. Place the DNA extraction purification column (ชุด) ลงในหลอดหมุนเหวี่ยงใหม่, leave it uncovered, and incubate at 65°C for 2 นาที. Extend this step as needed to evaporate ethanol to prevent ethanol residue from affecting downstream experiments.

14. ปิเปต 100μl ของบัฟเฟอร์การชะล้าง onto the column membrane, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 2 นาที.

(บันทึก: 1. Using 50μl of Elution Buffer to elute DNA can increase DNA concentration but reduce the overall DNA yield; 2. The eluate containing DNA can be reapplied to the DNA extraction purification column and centrifuged at 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 2 minutes again to increase DNA yield.)