บีซีเอ (กรดไบซินโคนิก) ชุดทดสอบโปรตีนเป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการวัดปริมาณความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่าง. การทดสอบนี้อาศัยการตรวจจับสีของทองแดง(ครั้งที่สอง) ไอออนลดลงด้วยโปรตีนภายใต้สภาวะที่เป็นด่าง. ความเข้มของสีม่วงที่ได้นั้นแปรผันตามความเข้มข้นของโปรตีน, ช่วยให้สามารถวัดปริมาณได้อย่างแม่นยำ.
นี่คือคำแนะนำทั่วไปเกี่ยวกับวิธีการใช้งาน บีซีเอ โปรตีน ชุดทดสอบ:
วัสดุที่จำเป็น:
- ชุดทดสอบโปรตีน BCA
- ตัวอย่างโปรตีน (สารละลายมาตรฐานหรือตัวอย่างที่ไม่รู้จัก)
- ไมโครเพลทหรือคิวเวตต์
- ไมโครปิเปตและทิป
- เครื่องอ่านไมโครเพลทหรือสเปกโตรโฟโตมิเตอร์
- น้ำกลั่น
ขั้นตอน:
- การจัดทำมาตรฐานโปรตีน:
- เตรียมชุดมาตรฐานโปรตีนพร้อมความเข้มข้นที่ทราบ. มาตรฐานเหล่านี้จะถูกใช้เพื่อสร้างเส้นโค้งมาตรฐานสำหรับการวัดปริมาณ.
- การเตรียมตัวอย่าง:
- เจือตัวอย่างโปรตีนของคุณให้มีความเข้มข้นภายในช่วงของมาตรฐาน. สิ่งสำคัญคือต้องมีตัวอย่างอยู่ในช่วงเชิงเส้นของการทดสอบเพื่อให้ได้ปริมาณที่แม่นยำ.
- การเตรียมรีเอเจนต์การทำงาน BCA:
- ผสมรีเอเจนต์ BCA A (สารละลายกรดไบซินโคนิก) และ BCA รีเอเจนต์ B (ทองแดง(ครั้งที่สอง) สารละลายซัลเฟต) ใน 50:1 อัตราส่วน. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้ผสมอย่างทั่วถึง.
- การฟักตัว:
- เพิ่ม BCA Working Reagent ลงในสารมาตรฐานและตัวอย่างของคุณ, แล้วบ่มส่วนผสมของปฏิกิริยาที่อุณหภูมิที่เหมาะสม (โดยทั่วไป 37°C) สำหรับ 30 นาที. ในช่วงเวลานี้, โปรตีนในตัวอย่างจะลดไอออนของทองแดง, ก่อตัวเป็นคอมเพล็กซ์สีม่วง.
- การวัด:
- หลังจากการฟักตัว, วัดค่าการดูดกลืนแสงของแต่ละหลุมที่ความยาวคลื่นโดยรอบ 562 nm โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทหรือเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์. การดูดกลืนแสงเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความเข้มข้นของโปรตีน.
- การสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน:
- พล็อตค่าการดูดกลืนแสงของมาตรฐานเทียบกับความเข้มข้นที่ทราบเพื่อสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน. เส้นโค้งนี้จะใช้เพื่อกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนของตัวอย่างที่ไม่รู้จัก.
- การหาปริมาณของตัวอย่างที่ไม่รู้จัก:
- วัดค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างที่ไม่รู้จัก และใช้เส้นโค้งมาตรฐานเพื่อระบุความเข้มข้นของโปรตีน.
- การวิเคราะห์ข้อมูล:
- คำนวณความเข้มข้นของโปรตีนตามเส้นโค้งมาตรฐาน. เครื่องอ่านไมโครเพลทส่วนใหญ่มีซอฟต์แวร์ที่สามารถทำให้กระบวนการนี้เป็นแบบอัตโนมัติได้.
- ผลลัพธ์:
- รายงานความเข้มข้นของโปรตีนในกลุ่มตัวอย่างของคุณในหน่วยที่เหมาะสม (เช่น., มก./มล) ขึ้นอยู่กับการทดสอบ BCA.
สิ่งสำคัญคือต้องปฏิบัติตามคำแนะนำเฉพาะที่ได้รับจากผู้ผลิตชุดทดสอบโปรตีน BCA, เนื่องจากโปรโตคอลที่แน่นอนอาจแตกต่างกันไปตามชุดอุปกรณ์. นอกจากนี้, ตรวจสอบให้แน่ใจว่ารีเอเจนต์ทั้งหมดได้รับการจัดเก็บอย่างเหมาะสม, และการทดสอบจะดำเนินการภายใต้เงื่อนไขที่แนะนำเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่แม่นยำและเชื่อถือได้.
ชุดทดสอบโปรตีน BCA ใช้โปรตีนรีดิวซ์ Cu2+ ให้เป็น Cu+ และหลักการที่ว่า BCA ก่อให้เกิดสารเชิงซ้อนสีม่วง-น้ำเงินที่มี Cu1+ ภายใต้สภาวะที่เป็นด่าง, ตามด้วยการตรวจจับการดูดกลืนแสงที่ 562 นาโนเมตร และเปรียบเทียบกับเส้นโค้งมาตรฐานเพื่อหาปริมาณโปรตีน.
รีวิว
ยังไม่มีบทวิจารณ์