หมายเลขแมว: BC3830

ขนาด: 50ที/48ส

พื้นที่จัดเก็บ： รีเอเจนต์ถูกขนส่งที่อุณหภูมิห้อง, เก็บไว้ตามความจำเป็นหลังจากเดินทางมาถึง, และมั่นคงภายใน 0.5 ปี.

ส่วนประกอบของผลิตภัณฑ์

รีเอเจนต์ Ⅰ: 20 มล.×1. การจัดเก็บที่ -20 ℃；

รีเอเจนต์ Ⅱ: 60 มล.×1. การจัดเก็บที่ -20 ℃.

รีเอเจนต์ Ⅲ: 0.55 มล.×1. การจัดเก็บที่ -20 ℃, หลีกเลี่ยงแสง. 5มาตรฐาน mM pNA: 1 มล.×1. การจัดเก็บที่ -20 ℃, หลีกเลี่ยงแสง.

การเตรียมสารเจือจางมาตรฐาน: เอา 9 มิลลิลิตรของรีเอเจนต์ Ⅰ แล้วเติม 1 มล. ของรีเอเจนต์ Ⅱ, ผสมให้เข้ากัน, และรอใช้งาน. (นอกจากนี้ยังสามารถเตรียมได้ตามอัตราส่วนของรีเอเจนต์ Ⅰ อีกด้วย: รีเอเจนต์ Ⅱ = 9:1).

รายละเอียดสินค้า:

แคสเปสเป็นตระกูลโปรตีเอสที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการอะพอพโทซิส, รวมถึงมากกว่า 10 สมาชิก. Caspase-3 เป็นโปรตีเอสส่วนปลายที่สำคัญที่สุดในกระบวนการอะพอพโทซิส, และยังเป็นแคสเปสที่ได้รับการศึกษามากที่สุดอีกด้วย; มันเปิดใช้งานโปรแคสเปส-2,6,7,9, ไฮโดรไลซ์โปรตีนอะพอพโทติกที่สำคัญหลายชนิดโดยเฉพาะ, เช่น PARP, และเป็นสื่อกลางในการควบแน่นของโครมาติน, การสร้างร่างกายแบบอะพอพโทติก, และการกระจายตัวของดีเอ็นเอนิวเคลียร์.

การสอบวิเคราะห์สี caspase-3 ขึ้นอยู่กับการไฮโดรไลซิสของสารตั้งต้นเปปไทด์ DEVD-pNA (งูเห่า- กลู-วาล-แอสพี-พี-ไนโตรอะนิไลด์) โดยแคสเพส-3, ส่งผลให้มีการปล่อย p-nitroaniline (พีเอ็นเอ) ความเปียกชื้น. พี- Nitroaniline มีการดูดกลืนแสงสูงที่ 405 นาโนเมตร. กิจกรรมของแคสเปสสามารถคำนวณได้โดยการตรวจจับ pNA. ชุดนี้เหมาะสำหรับเนื้อเยื่อและเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม.

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้:

เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลท, 100คิวเวตต์ µL/ จาน 96 หลุม, เครื่องหมุนเหวี่ยง, อ่างน้ำ/ตู้ฟัก, ปิเปตแบบปรับได้, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, น้ำแข็ง, และน้ำกลั่น.

ขั้นตอน:

ก. การจัดเตรียมตัวอย่าง:

1. เซลล์: เก็บเซลล์ไว้ในหลอดหมุนเหวี่ยง, ปั่นแยกและทิ้งส่วนเหนือตะกอน; เพิ่ม100μL Reagent Ⅱ ให้กับจำนวนเซลล์ (เกี่ยวกับ 106 เซลล์), เขย่าและแขวนตะกอนอีกครั้ง, จากนั้นยืนบนน้ำแข็งเป็นเวลา 15 นาที, เครื่องหมุนเหวี่ยง 15,000 กรัม ที่อุณหภูมิ 4°C สำหรับ 10 15 นาที, นำส่วนที่อยู่เหนือตะกอนมาวางบนน้ำแข็งเพื่อ (สามารถเพิ่มเป็น 150-200 μL Reagent Ⅱ หากการแคร็กไม่เพียงพอ)
2. เนื้อเยื่อ: ตามอัตราส่วนของมวลเนื้อเยื่อ (ก): ปริมาตรของรีเอเจนต์ Ⅱ (มล) ของ 1:5-10 (ขอแนะนำให้ชั่งน้ำหนักประมาณ 0.1 กรัมของเนื้อเยื่อและเพิ่ม 1 มล. ของรีเอเจนต์ Ⅱ), บดในอ่างน้ำแข็งหรือตัดให้ละเอียด, วางบนน้ำแข็งเพื่อ 15 นาที, ปั่นแยกที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 10-15 นาที, นำส่วนลอยเหนือตะกอนมาวางบนน้ำแข็งเพื่อทำการทดสอบ.

บี. การกำหนด ขั้นตอน:

1. เปิดเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลทก่อน 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 405 นาโนเมตร, และปรับน้ำกลั่นให้เป็นศูนย์.
2. ก่อนใช้งาน, 5 สารละลายมาตรฐาน PNA ของ mmol/L ถูกเจือจาง 200, 100, 50, 25, 5, และ 0 สารละลายมาตรฐาน μmol/L พร้อมตัวเจือจางสารละลายมาตรฐาน.
3. การกำหนดตัวอย่าง (เติมรีเอเจนต์ต่อไปนี้ตามลำดับ 96 จานดี / อีทูป)

ค. กิจกรรม การคำนวณ:

1. การสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน

สมการมาตรฐานจัดทำขึ้นตามความเข้มข้นของหลอดมาตรฐาน (x, ไมโครโมล/ลิตร) และ ∆AS (ย, ลบท่อด้วย 0 ความเข้มข้น). การหาค่า ΔAT จะถูกแทนที่ในสมการมาตรฐานเพื่อให้ได้ x (ไมโครโมล/ลิตร).

2. ตามเปอร์เซ็นต์ที่เพิ่มขึ้นของการทำงานของเอนไซม์

เปอร์เซ็นต์ที่เพิ่มขึ้นของการออกฤทธิ์ของแคสเพส-3 = ((กลุ่มบำบัดทดลอง AT)- เอบี) / ((กลุ่มควบคุมทดลอง AT)- เอบี) × 100%

วิธีนี้ง่ายและเชื่อถือได้ และสามารถใช้เพื่อระบุกิจกรรมของเอนไซม์โดยประมาณได้.

3. คำนวณโดยกิจกรรมของเอนไซม์

หนึ่งหน่วยคือปริมาณของเอนไซม์ที่จะแยกตัว 1.0 nmol ของสารตั้งต้น pNA ที่มีการวัดสีต่อชั่วโมงที่ 37°C ภายใต้ความเข้มข้นของสารตั้งต้นที่อิ่มตัว. เราสามารถคำนวณกิจกรรมแคสเพสในตัวอย่างได้.

กิจกรรมแคสเปส-3 (U/มก) = x × VR ۞ (VS × ซีพีอาร์ ) ۞ × 103 = 2x ÷ ซีพีอาร์ ฮอท

วีอาร์: ปริมาตรรวมของระบบปฏิกิริยา, 0.1 มล. = 10-4 ล; VS: ปริมาณตัวอย่างที่เพิ่ม, 0.05 มล; ต: เวลาการเกิดปฏิกิริยา, 1 ชม.; ซีพีอาร์: ความเข้มข้นของโปรตีนตัวอย่าง, มก./มล; 103: ค่าสัมประสิทธิ์การแปลงหน่วย, 1 ไมโครโมล = 103 นาโนโมล.

บันทึก:

1. เนื่องจากรีเอเจนต์ ฉันมีสารรีดิวซ์ (ดีทีที), ขอแนะนำให้เจือจางตัวอย่าง 2 ครั้งด้วยน้ำกลั่นแล้วใช้วิธีแบรดฟอร์ดในการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนเพื่อลดการรบกวนของ DTT ในการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีน. ไม่แนะนำให้ใช้วิธี BCA เพื่อตรวจวัดโปรตีน
2. สาเหตุที่พบบ่อยที่สุดสำหรับค่ากิจกรรมของแคสเปสต่ำก็คือเซลล์ไม่เกิดอะพอพโทซิส, จำนวนเซลล์น้อยเกินไปหรือเวลาในการสังเกตคือเมื่อกระตุ้นการตายของเซลล์, ไม่ใช่ว่าขนาดยาจะมากขึ้น, ยิ่งเวลานานเท่าไร, ยิ่งกิจกรรมแคสเปสสูงขึ้น. แนะนำให้กำหนดขนาดยาและจุดเวลาที่แตกต่างกัน เช่น 0, 2, 4, 8, 16, และ 24 ชั่วโมงเพื่อตรวจจับจุดสังเกตที่ดีที่สุด.
3. เมื่อค่าของตัวอย่างที่วัดได้สูงกว่าขีดจำกัดด้านบนของเส้นโค้งมาตรฐาน, ตัวอย่างสามารถเจือจางด้วยรีเอเจนต์ Ⅱ จากนั้นจึงวัดอีกครั้ง.
4. ปิดเพลต 96 หลุมให้แน่น และปิดด้วยพาราฟิล์ม. ฟักตัวที่ 37 องศาเซลเซียส, ค่า OD405 เมื่อสีเปลี่ยนเป็นสีเหลืองประมาณนั้น 0.2, ซึ่งสามารถวัดได้ในเวลานี้. การเปลี่ยนสีเล็กน้อยอาจทำให้ปฏิกิริยายืดเยื้อหรือข้ามคืนได้, แต่เมื่อเอนไซม์มีฤทธิ์แรง, เวลาฟักตัวนานเกินไปจะทำให้ปฏิกิริยาสูญเสียเส้นตรง

การอ้างอิงผลิตภัณฑ์ล่าสุด：

• วัง บี , วัง เค , จิน ที , และคณะ. NCK1-AS1 ช่วยเพิ่มการเพิ่มจำนวนเซลล์ glioma, ความต้านทานรังสี, และความต้านทานต่อสารเคมีผ่านทางเดิน miR-22-3p/IGF1R ceRNA[เจ]. ชีวการแพทย์ & เภสัชบำบัด, 2020, 129:110395.
• วัง ซี , ซู เจ เอช , มู เจ เจ , และคณะ. การค้นพบโครงสร้างพื้นฐานแบบใหม่เกี่ยวกับไมโตคอนเดรียหัวใจของการรวมตัวกันของ Brandt'svoles ในสภาพแวดล้อมที่หนาวเย็นเล็กน้อย[เจ]. ชีวเคมีเปรียบเทียบและสรีรวิทยา – ส่วนที่ 1 โมเลกุล & สรีรวิทยาเชิงบูรณาการ, 2020, 249:110766.

อ้างอิง:

• โคเฮน จีเอ็ม. แคสเปส: ผู้ประหารชีวิตอะพอพโทซิส. ไบโอเคม เจ, 1997, 326:1-16.
• เจนิเก้ อาร์ ยู, สเปรงการ์ต ม.ล, วาติ ม.ร, และบทบาทใหม่ของ caspase-3 ในการตายของเซลล์[เจ]. การตายของเซลล์และการสร้างความแตกต่าง, 1999, 6:99-104.

สินค้าที่เกี่ยวข้อง:

ชุดทดสอบกิจกรรม BC3810 Caspase-1 ชุดทดสอบกิจกรรม BC3820 Caspase-2 ชุดทดสอบกิจกรรม BC3840 Caspase-4 ชุดทดสอบกิจกรรม BC3850 Caspase-5 ชุดทดสอบกิจกรรม BC3860 Caspase-6 ชุดทดสอบกิจกรรม BC3880 Caspase-8 ชุดทดสอบกิจกรรม BC3890 Caspase-9