ส่วนประกอบ:

สารสกัดโซลูชั่น: 80ml×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ 1: 40ml×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ 2: ผง×1. การจัดเก็บที่ -20 ℃, dissolve with 1ml of acetone. The dissolved reagent 2 can be stored at -20℃ after dispensing. เจือจาง 100 times when used.

รีเอเจนต์ 3: ผง×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃, dissolve with 3ml of acetone before use. รีเอเจนต์ 4: 5ml×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รายละเอียดสินค้า:

Mitochondrial complex II is the same as succinate-Co-enzyme Q reductase, which exists widely in mitochondria of animal, ปลูก, จุลินทรีย์และเซลล์เพาะเลี้ยง. It catalyzes succinic acid to form fumaric acid, reduce FAD to form FADH2. The FADH2 reduce oxidized CoQ to form reduced CoQ, which is a branch of respiratory electron transport chain.

CoQ that a catalytic product of complex II could reduce 2,6-dichloroindophenol, which has absorbance at 605 นาโนเมตร, the activity of enzyme can be calculated by detecting the decrease rate of 2, 6-dichlorindolepheno.

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้:

สเปกโตรโฟโตมิเตอร์, อ่างอาบน้ำ, เครื่องหมุนเหวี่ยงบนโต๊ะ, ปิเปตโอน, 1ml glass cuvette, mortar/ homogenizer, acetone, น้ำแข็งและน้ำกลั่น.

1. Complex II extraction:

• Collecting 0.1g of tissue or 5 ล้านเซลล์, add 1ml extract solution and grind on ice with mortar/homogenizer;
• centrifuge at 600g and 4℃for 10 นาที. Discard the precipitate and transfer supernatant to another tube, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่, 11000g and 4℃ for 15 นาที;
• The supernatant, เช่น., cytoplasmic extract, can be used to determine the complex II leaking from mitochondria, this step can show the effect of mitochondrial extraction;
• เพิ่ม 400 μL extraction solution to sediment, splitting with ultrasonication (พลัง 20%, work time 5s, ช่วงเวลา 10 วินาที, ทำซ้ำ 15 ครั้ง), used to detect Complex Ⅱ activity and protein content.

Determining step

1. Preheat spectrophotometer for 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 605 นาโนเมตร, ตั้งตัวนับเป็นศูนย์ด้วยการกลั่น
2. การกำหนดตัวอย่าง

• Making working solution: mix reagent 2 and reagent 3 according to 1:1 ก่อนใช้งาน. Prepare when used. Prepared when the solution will be used.
• Preheat reagent1 at 37℃ (เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) หรือ 25 ℃(สายพันธุ์อื่น) สำหรับ 15
• Add the following reagents in 1ml glass cuvette:

การคำนวณ:

คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1nmol of 2, 6-dichlorindolepheno per mg of tissue protein in every minute.

Complex Ⅱ Activity (U/มก)-[ΔA×Vrv÷(ε×d)×109]÷(เทียบกับ×ซีพีอาร์)÷T =476.2×ΔA÷Cpr

ε: 2, 6-dichlorindolepheno molar extinction coefficient, 2.1×104L/mol/cm; ง: light path of cuvette, 1 cm;

เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด,1มล; เทียบกับ: ปริมาณตัวอย่าง (มล), 0.05 มล;

ซีพีอาร์: ตัวอย่างความเข้มข้นของโปรตีน (มก./มล); ต: เวลาการเกิดปฏิกิริยา (นาที), 2 นาที;

บันทึก:

1. Take two or three different samples for prediction before test to ensure the accuracy of experimental results. Dilute supernatant with distilled water if absorbance is higher than 1.5. Dilute sample with distilled water if ΔA>0.4, multiply dilute times in the formula. Increase sample volume if ΔA is slow.
2. Detect sample protein concentrate by yourself, you can use โซลาบิโอ (PC0020 บีซีเอ โปรตีน ชุดทดสอบ). Because protein is contained in the extract, the protein content of the extract itself should be subtracted when determining the protein concentration of the sample.
3. It is recommended to use the sample protein concentration to calculate the enzyme activity. If the sample fresh weight is used to calculate, the enzyme activity of cytoplasmic extract needs to be measured, and the sum of supernatant and precipitation enzyme activity is the total enzyme activity.
4. It’s enough for 50 tube reactions.
5. เอกสารแนบ: น้ำหนักตัวอย่าง(50ที/24ส)

• เหนือตะกอน:

คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1nmol of 2, 6-dichlorindolepheno in 1 min every gram of tissue weight.

Complex Ⅱ Activity(U/g)-[ΔA1×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =476.2×ΔA1÷W ΔA1: supernatant absorbance;

เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด,1มล;

ε: 2, 6-dichlorindolepheno molar extinction coefficient, 2.1×104L/mol/cm; ง: light path of cuvette, 1 cm;

เวอ: extract solution volume,1มล; เทียบกับ: ปริมาณตัวอย่าง (มล), 0.05 มล; ต: เวลาการเกิดปฏิกิริยา (นาที), 2 นาที;

ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก.

• Sediment:

คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1nmol of 2, 6-dichlorindolepheno in 1 min every gram of tissue weight.

Complex Ⅱ Activity(U/g)- [ΔA2×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =190.5×ΔA2÷W ΔA2: sediment absorbance;

เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด,1มล;

ε: 2, 6-dichlorindolepheno molar extinction coefficient, 2.1×104L/mol/cm; ง: light path of cuvette, 1 cm;

เวอ: sediment resuspended volume,0.4 มล; เทียบกับ: ปริมาณตัวอย่าง (มล), 0.05 มล;

ต: เวลาการเกิดปฏิกิริยา (นาที), 2 นาที; ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก.

• Total activity is the sum of ComplexⅡactivity in supernatant and sediment. Complex Ⅱ(U/g) =476.2×ΔA1÷W+190.5×ΔA2÷W.

ตัวอย่างการทดลอง:

1. Take 0.1g of rabbit liver sample, เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของสารละลายสารสกัด, grind and centrifuge the homogenate, and operate according to the determination steps. ΔA1 = A1-A2 = 1.134-1.054 - 0.08 in the supernatant, and ΔA2 =A1-A2 = 1.371-1.347 - 0.024 in the precipitation.

The activity of complex II in the supernatant (มวลยู/กรัม) = 476.2×ΔA1÷W = 476.2 × 0.08÷0.1 = 380.96 มวลยู/กรัม

The activity of complex II in the precipitation (มวลยู/กรัม) = 190.5×ΔA2÷ W = 190.5×0.024÷0.1 = 45.72

มวลยู/กรัม

Complex II (มวลยู/กรัม) = 476.2× ΔA1÷W + 190.5×ΔA2÷W = 476.2×0.08÷0.1 + 190.5×0.024 ÷ 0.1 =426.8U/g mass.

อ้างอิง：

[1] Mühling J, Tiefenbach M, López-Barneo J, และคณะ. Mitochondrial complex II participates in normoxic and hypoxic regulation of α-keto acids in the murine heart[เจ]. Journal of molecular and cellular cardiology, 2010, 49(6): 950-961.

สินค้าที่เกี่ยวข้อง：

BC0510/BC0515 Electron Transport Chain Complex I Activity Assay Kit

BC3240/BC3245 Electron transport chain Complex Ⅲ Activity Assay Kit

BC0940/BC0945 Electron transport chain Complex Ⅳ Activity Assay Kit

BC1440/BC1445 Electron transport chain Complex Ⅴ Activity Assay Kit