Solarbio ออกซิไดซ์กลูตาไธโอน (จีเอสเอสจี) ชุดทดสอบเนื้อหา

กลูตาไธโอนออกซิไดซ์ (จีเอสเอสจี) ชุดทดสอบเนื้อหา

บันทึก: ใช้ตัวอย่างที่แตกต่างกันสองหรือสามตัวอย่างเพื่อทำนายก่อนการทดสอบ.

อุปกรณ์การดำเนินงาน: เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลท

หมายเลขแค็ตตาล็อก: BC1185

ขนาด:100ที/96ส

ส่วนประกอบ:

รีเอเจนต์ I:100 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. รีเอเจนต์ II: 130 ไมโครลิตร×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. รีเอเจนต์ III: 20 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. รีเอเจนต์ IV:2.5 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ V: Powder ×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. Dissolve with 2.5 mL of distilled water when the solution will be used, then split into smaller packages, store at -20℃.

Reagent VI:12.5 ไมโครลิตร×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. Prepare Reagent VI and distilled water according to the sample size at the ratio of 1:20 (วี: วี) ก่อนใช้งาน.

มาตรฐาน: ผง 10 mg×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รายละเอียดสินค้า

กลูตาไธโอนออกซิไดซ์(จีเอสเอสจี) is an oxidized form of glutathione (จีเอสเอช), also known as dithioneglutathione, formed by the oxidation of two molecules of glutathione. GSSG is reduced to GSH by glutathione reductase, so most of the body is in the reduced form. The determination of GSH and GSSG content and ratio of GSH/GSSG in cells can reflect the redox status of cells. This kit utilizes reaction of glutathione and 5, 5′-dithiobis-2-nitrobenoic acid (DTNB) to produce 5-thio-2- nitrobenzoic acid. 5-thio-2- nitrobenzoic acid has the largest absorption at wavelength of 412 นาโนเมตร, and 2-Vinylpyridine inhibit reduced glutathione in the original of samples, and then using glutathione reductase to reduce GSSG to GSH, determining the content of Oxidized Glutathione.

ข้อกำหนดทางเทคนิค

Minimum Detection Limit：3.211 มก./มล

ช่วงเชิงเส้น：3.9-125 มก./มล

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้.

Analytical balance, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, refrigerated centrifuge, water-bath, ปิเปตแบบปรับได้, spectrophotometer/ microplate reader, คิวเวทท์แก้วไมโคร/แผ่นก้นแบน 96 หลุม.

ขั้นตอน

ฉัน. ตัวอย่าง preparation

1. 1. ตัวอย่างเนื้อเยื่อ

Wash fresh tissues with PBS for twice, จากนั้นเพิ่ม 0.1 g of sample into the homogenizer (the homogenizer has been rinsed with Reagent I and placed on ice before use). เพิ่ม 1 mL of Reagent I (the proportion of tissue and reagents can be kept constant), บดน้ำแข็งจนสุด (using liquid nitrogen will have a better grinding effect). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×g and 4℃ for 10 นาที, take the supernatant and place it at 4℃ for test. (The supernatant can be stored at -80℃ for 10 days.)

2. Blood sample

พลาสมา: Sample is centrifuged at 600 ×g and 4℃ for 10 นาที. Absorbing the upper plasma into another tube add with same volume Reagent I. เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×g and 4℃ for 10 นาที, take the supernatant and place it at 4℃ for test. (The Supernatant can be stored at -80℃ for 10 days.)

Blood cell:Sample is centrifuged at 600 ×g and 4℃ for 10 นาที. Discarding the upper plasma, wash with treble volume of PBS for 3 ครั้ง (mix blood cell with PBS centrifuge at 600 ×กรัม สำหรับ 10 นาที), add equal volume of Reagent I. After mixing, it is placed at 4℃ for 10 นาที. เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาที, take the supernatant and place it at 4℃ for test. (The supernatant can be stored at -80℃ for 10 days.)

3. Cell sample

Harvesting cell should not less than 106,then wash with PBS for twice (mix cell with PBS centrifuge at 600×g for 10 นาที), mix precipitated cell with the volume of PBS for 3 ครั้ง. Repeated freezing and thawing 2–3 times (suggest frozen in liquid nitrogen, dissolved in 37℃ water bath). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาที, take the supernatant and place it at 4℃ for test. (The supernatant can be stored at -80℃ for 10 days.)

ครั้งที่สอง. ขั้นตอน

1. เปิดเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลทสำหรับ 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 412 นาโนเมตร, set the counter to zero with distilled
2. Preheat Reagent II in water bath for 30 นาที: 37℃ (mammal cell) หรือ 25 ℃ (สายพันธุ์อื่น).
3. The standard dilution: dissolve standard with 1 มิลลิลิตรของน้ำกลั่น (4℃) to a concentration of 10 มก./มล. Take suitable solution to prepare the standard of concentration of 125μg/mL、 5มก./มล、31.25มก./มล、15.625มก./มล、7.8125มก./มล、3.90625μg/mLand0μg/mL (The diluent is a ten-fold diluted Reagent I).

4. เพิ่ม 20 μL of diluted standard or sample to 0.5 mL centrifuge tube, เพิ่ม 1 μL ของรีเอเจนต์ II, incubate at 37 ℃ for 30 minutes after mixing.
5. Make standard curves

After the incubation, เพิ่ม 140 μL of Reagent III, 20 μL of Reagent IV, 20μL of Reagent V, และ 2 μL of Reagent VI to the standard tube in sequence. After rapid mixing, the light absorption A1 and A2 of 30 s and 150 s respectively were measured at 412 นาโนเมตร. Absorbance (A2-A1) is the abscissa (x) and concentration is the ordinate (ย), making the standard curve.

เพิ่ม 140 μL of Reagent III, 20 μL of Reagent IV, 20 μL of Reagent V, และ 2 μLof Reagent VI to the sample tubes in sequence. After rapid mixing, the light absorption A1 and A2 of 30 s and 150 s respectively were measured at 412 นาโนเมตร, ΔA= A2- A1.

สาม. Calculations

According to the standard curve, sample ΔA into the formula (x), calculate the sample concentration of y

(μg/ml).

• ความเข้มข้นของโปรตีน

GSSH (มก / mg prot)=y×Vrv÷Vrv÷Cpr =y÷Cpr

• น้ำหนักตัวอย่าง

GSSH (μg /g)= y×Vrv÷(Vrv÷Vsv×W)= y÷W

• เซลลาเมาท์

GSSH (มก /106 เซลล์)= y×Vrv÷(Vrv÷Vsv×N)= y÷N

• Solution volume

GSSH (มก / มล)= y×Vrv/Vs= 2y

เอ็น: จำนวนเซลล์,106；

เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด, 0.203 มล；

เทียบกับ: The volume of supernatant was added into the reaction system, 20 μL=0.02 mL； ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก;

ซีพีอาร์: Supernatant protein concentration, มก./มล.

หมายเหตุ:

1. The sample needs to be homogenized completely. If the test cannot be completed temporarily, it can be stored at-80℃.
2. If the content of GSSG content in the sample is uncertain, several gradients can be diluted before measurement.
3. This method uses the enzymatic reaction rate to calculate the substrate concentration and complete readings as accurately as possible at 30 และ 150
4. Reagent I contained protein precipitant, the supernatant could not be used for protein concentration determination. If the protein content needs to be determined, take another tissue.

Reference:

• Alpert A J, Gilbert H F. Detection of oxidized and reduced glutathione with a recycling postcolumn reaction[เจ]. Analytical biochemistry, 1985, 144(2):553-562.
• Owens C W I, Belcher R A colorimetric micro-method for the determination of glutathione[เจ]. Biochemical Journal, 1965, 94(3): 705.

สินค้าที่เกี่ยวข้อง：

BC1170/ BC1175 Reduced Glutathione（GSH）Assay Kit

BC1190/ BC1195 Glutathione Peroxidase Assay Kit

BC0350/ BC0355 Glutathione S-transferase(GST) ชุดทดสอบกิจกรรม

BC1160/ BC1165 Glutathione Reductase (GR) ชุดทดสอบ