ไพรูเวต คาร์บอกซิเลส (พีซี) ชุดทดสอบกิจกรรม
บันทึก: ใช้ตัวอย่างที่แตกต่างกันสองหรือสามตัวอย่างเพื่อทำนายก่อนการทดสอบ.
อุปกรณ์การดำเนินงาน: สเปกโตรโฟโตมิเตอร์
หมายเลขแมว: BC0730
ขนาด:50ที/48ส
ส่วนประกอบ:
สารสกัดโซลูชั่น: ของเหลว 110 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.
รีเอเจนต์ I: ของเหลว 30 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.
รีเอเจนต์ II: ของเหลว 10 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.
รีเอเจนต์ III: ผง×1. การจัดเก็บที่ -20 ℃. ละลายไปกับ 5 มิลลิลิตรของน้ำกลั่น, store at -20℃ after prepared.
รีเอเจนต์ IV: ผง×1. การจัดเก็บที่ -20 ℃. ละลายไปกับ 5 มิลลิลิตรของน้ำกลั่น, store at -20℃ after prepared.
รีเอเจนต์ V: ของเหลว 5 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.
รีเอเจนต์ VI: ของเหลว 15 ไมโครลิตร×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.
Reagent VI Diluent Solution: ของเหลว 10 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.
รายละเอียดสินค้า:
Pyruvate carboxylase (พีซี, อีซี 6.4.1.1) is widely present in mitochondria of animals, molds and yeast, but is not found in plants and most bacteria. PC is the main postreaction for oxaloacetate, and is the first-rate- limiting enzyme in the gluconeogenesis process.
PC irreversibly catalyzes pyruvate, ATP, CO2 and water to oxaloacetate, ADP and Pi, malic dehydrogenase further catalyzes the formation of malic acid and NAD+ from acetoacetic acid and NADH. The enzyme activity of PC can be reflected by detecting the oxidation rate of NADH at 340 นาโนเมตร.
รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้:
Ultraviolet spectrophotometer, อ่างอาบน้ำ, เครื่องหมุนเหวี่ยงบนโต๊ะ, อ่างอาบน้ำ, ปิเปตแบบปรับได้, 1 mL quartz cuvette, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, น้ำแข็งและน้ำกลั่น.
ขั้นตอน:
ฉัน. Complex extraction:
- Collecting 0.1 g of tissue or 5 ล้านเซลล์, เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของสารละลายสารสกัด, grinding on ice with mortar/homogenizer.
- เครื่องปั่นแยกที่ 1000 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at4℃,
- Take the supernatant to other tube and centrifuge at 11000 ×กรัม สำหรับ 15 minutes at4℃.
- The supernatant is used to detect PC that leaking from mitochondria, which shows the effect of mitochondrial extraction.
- เพิ่ม 1 mL of Extract solution to the sediment, splitting with ultrasonic (พลัง 20%, work time 5s, ช่วงเวลา 10 วินาที, ทำซ้ำ 12 ครั้ง), used to detect the enzyme activity of PC and protein content.
ครั้งที่สอง. การกำหนด ขั้นตอน:
- Preheat ultraviolet spectrophotometer for 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 340 นาโนเมตร, ตั้งศูนย์ด้วยน้ำกลั่น.
- Preheat Reagent I at 37℃ for 15 นาที.
- Diluent Reagent VI according to the volume ratio of Reagent VI: Reagent VI Diluent Solution = 1.6:660(วี:วี), prepare the reagent when it will be used.
- วิธีแก้ปัญหาการทำงาน: make the solution as the volume ratio of Reagent II: รีเอเจนต์ III: Reagent IV= 2:1:1, prepare the reagent when it will be used.
- Add the following reagents in 1 mL quartz cuvette:
| รีเอเจนต์ (ไมโครลิตร) | หลอดเปล่า (บี) | หลอดทดลอง (ต) |
| รีเอเจนต์ I | 450 | 450 |
| วิธีแก้ปัญหาการทำงาน | 320 | 320 |
| รีเอเจนต์ V | 80 | 80 |
| รีเอเจนต์ VI | 100 | 100 |
| ตัวอย่าง | – | 50 |
| น้ำกลั่น | 50 | – |
| Add the above reagents to the 1 mL quartz cuvette in order, timing after add working solution, mix thoroughly. Detect the absorbance at 340 nm at the time of 10 วินาที, record as AT1 or AB1. Then place dishes with the reaction solution in a 37℃ water bath for 2 นาที. Take it out and wipe it clean, immediately measure the absorbance at the time of 130 วินาที, which record as AT2 or AB2. ΔAT= AT1- AT2, ∆AB= AB1- AB2, ΔA= ΔAT-ΔAB. The blank tube only need to test once or twice. | ||
สาม. การคำนวณ:
คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the production of 1 nmol of NADH per minute every milligram of protein.
PC Activity(U/มก)-[ΔA×Vrv÷(ε×d)×109]÷(เทียบกับ×ซีพีอาร์)÷T =1607×ΔA÷Cpr
ε: NADH molar extinction coefficient, 6.22×103 L/mol/cm; ง: Light path of cuvette, 1 cm;
เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด,1×10-3 L; เทียบกับ: ปริมาณตัวอย่าง (มล), 0.05 มล;
ซีพีอาร์: ตัวอย่างความเข้มข้นของโปรตีน (มก./มล); ต: Reaction time (นาที), 2 นาที;
109: 1 mol=109 nmol.
บันทึก:
- Take one or two different samples for prediction before test. It is recommended to dilute the crude enzyme solution with the Extract solution before the determination if the ΔA>0.8(if measuring with 96 well flat-bottom UV plate, ∆A>0.5). While, extending the response time (5 minutes or 10 นาที) if ΔA <0.01.
- The blank tube is a detection hole for detecting the quality of each reagent component, and normally that the change of ΔAB does not exceed 0.05.
- The protein concentration of the sample needs to be determined by yourself. Since the Extract solution contains a relatively high protein concentration (เกี่ยวกับ 1 มก./มล), the protein concentration of the Extract solution must be deducted when measuring the protein concentration of the sample.
- It is recommended to use the sample protein concentration to calculate the enzyme activity. If the sample fresh weight is used to calculate, the enzyme activity of cytoplasmic extract needs to be measured, and the sum of supernatant and precipitation enzyme activity is the total enzyme activity.
- Reagents in this kit are sufficient to complete 50 tube reactions.
- Appendix: calculation formula of sample weight: (sample test number is50T/24S)
1) เหนือตะกอน:
คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is the amount of enzyme catalyzes the production of 1 nmol of NADH per minute every gram of tissue.
PC Activity (น้ำหนักยู/กรัม) -[ΔA1×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA1÷W
ΔA1: Supernatant absorbance;
ε: NADH molar extinction coefficient, 6.22×103 L/mol/cm; ง: Light path of cuvette, 1 cm;
เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด,1×10-3 L; เทียบกับ: ปริมาณตัวอย่าง (มล), 0.05 มล; เวอ: Extraction solution, 1 มล;
ซีพีอาร์: ตัวอย่างความเข้มข้นของโปรตีน (มก./มล); ต: Reaction time (นาที), 2 นาที;
109: 1 mol=109 nmol;
ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก.
2) Sediment:
คำจำกัดความของหน่วย: One unit of enzyme activity is the amount of enzyme catalyzes the production of 1 nmol of NADH per minute every gram of tissue.
PC Activity (น้ำหนักยู/กรัม) -[ΔA2×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA2÷W
ΔA2: Sediment absorbance;
ε: NADH molar extinction coefficient, 6.22×103 L/mol/cm; ง: Light path of cuvette, 1 cm;
เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด,1×10-3 L; เทียบกับ: ปริมาณตัวอย่าง (มล), 0.05 มล;
เวอ: Sediment heavy suspension volume, 1 มล; ซีพีอาร์: ตัวอย่างความเข้มข้นของโปรตีน (มก./มล); ต: Reaction time (นาที), 2 นาที;
109: 1 mol=109 nmol;
ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก.
3) Total activity
Total activity is the sum of PC activity in supernatant and sediment. พีซี(น้ำหนักยู/กรัม)=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W.
ตัวอย่างการทดลอง:
- 1 mL of Extract solution is added to 0.1 g of rabbit heart tissue for homogenization. The supernatant is diluted 100 times with Extract solution, and the precipitation was diluted 4 ครั้ง. แล้ว, measured by microquartzplate according to the determination steps, เหนือตะกอน: the ΔAT = A1T – A2T = 1.104-0.856 =0.248, ΔAB = A1B – A2B = 1.021-0.988=0.033, Δ A1 = ΔAT – ΔAB = 0.248-0.033=0.215, precipitate: ΔAT = A1T – A2T = 1.07-0.716 =0.354, ΔAB= A1B- A2B = 1.021-0.988=0.033, ΔA2 = ΔAT- ΔAB =0.354-0.033= 0.321
เหนือตะกอน: the activity of PC (มวลยู/กรัม) - 1607 × Δ A1 ÷ W × 100 (อัตราส่วนการเจือจาง) = 1607×0.215÷0.1× 100 - 345505 มวลยู/กรัม;
Precipitation: the enzyme activity of PC (มวลยู/กรัม) = 1607×ΔA2 ÷ W×4 (อัตราส่วนการเจือจาง) = 1607×0.321÷ 01.
× 4=20633.88 U/g mass;
The total enzyme activity of PC (มวลยู/กรัม) = 1607×ΔA1÷W×100 (dilution) + 1607×ΔA2 ÷ W
=1607 × 0.215 ÷0.1×100+1607×0.321÷0.1×4=366138.88 U/g mass.
อ้างอิง
[1] Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Evaluation of Oxidative Stress Status in Aged Human in relation to some Diseases. International Conference on Pure and Applied Sciences. August 2018;
สินค้าที่เกี่ยวข้อง
BC0920/BC0925 Fructose 1,6-bisphosphatase (FBP) ชุดทดสอบกิจกรรม
BC3320/BC3325 Glucose-6-phosphatase Activity Assay Kit
BC3310/BC3315 Phosphoenolpyruvate Carboxykinase (PEPCK) ชุดทดสอบกิจกรรม
รีวิว
ยังไม่มีบทวิจารณ์