Solarbio ลดกลูตาไธโอน (จีเอสเอช) ชุดทดสอบเนื้อหา

Reduced Glutathione (จีเอสเอช) ชุดทดสอบเนื้อหา

บันทึก: ใช้ตัวอย่างที่แตกต่างกันสองหรือสามตัวอย่างเพื่อทำนายก่อนการทดสอบ.

อุปกรณ์การดำเนินงาน: Spectrophotometer/Microplate Reader

หมายเลขแค็ตตาล็อก: BC1175

ขนาด: 100ที/96ส

ส่วนประกอบ:

รีเอเจนต์ I: 100 มล.×1. เก็บที่อุณหภูมิ 4 ℃.

รีเอเจนต์ II: 20 มล.×1. เก็บที่อุณหภูมิ 4 ℃.

รีเอเจนต์ III: 8 มล.×1. เก็บที่อุณหภูมิ 4 ℃, protect from light.

มาตรฐาน: ผง 10 mg×1. เก็บที่อุณหภูมิ 4 ℃, protect from light.

รายละเอียดสินค้า

Glutathione is a natural tripeptide composed of glutamic acid (กลู), cysteine (ซิส) and glycine (Gly). It is a kind of compound containing sulfhydryl group (-SH), which widely exists in animal tissue, เนื้อเยื่อพืช, microorganism, and yeast. Glutathione can react with 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) to produce 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid and glutathione disulfide (จีเอสเอสจี). 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid is a yellow product, with the maximum absorption at 412 นาโนเมตร.

ข้อกำหนดทางเทคนิค

Minimum Detection Limit：3.763 มก./มล

ช่วงเชิงเส้น：12.5-400 มก./มล

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้

Analytical balance, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, เครื่องหมุนเหวี่ยงอุณหภูมิต่ำ, อ่างอาบน้ำ, ปิเปตแบบปรับได้, เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลท, micro glass cuvette or 96 well flat-bottom plate and distilled water.

ขั้นตอน

ฉัน. การจัดเตรียมตัวอย่าง

1. ตัวอย่างเนื้อเยื่อ

Wash fresh tissues with PBS for twice, จากนั้นเพิ่ม 0.1 g of animal/plant tissue into homogenizer (the homogenizer has been rinsed with Reagent I and placed on ice before use). เพิ่ม 1 mL of Reagent I (the proportion of tissue and Reagents can be kept constant), บดน้ำแข็งจนสุด (using liquid nitrogen will have a better grinding effect). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃, take the supernatant and place it at 4℃ for test. (If the test cannot be completed temporarily, the supernatant can be stored at -80℃ for 10 days.)

2. Blood sample

พลาสมา: Sample is centrifuged at 600 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃. Absorbing the upper plasma into another tube with adding the same volume Reagent I. เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃, take the supernatant and place it at 4℃for test. (If the test cannot be completed temporarily, the supernatant can be stored at -80℃ for 10 days.)

Blood cell: Sample is centrifuged at 600 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃. Discarding the upper plasma, wash with three times volume of PBS for 3 ครั้ง (re-suspend blood cell with PBS, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 600 ×กรัม สำหรับ 10 นาที), add equal volume of Reagent I. After mixing, it is placed at 4℃ for 10 นาที. เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาที, take the supernatant and place it at 4℃ for test. (If the test cannot be completed temporarily, the supernatant can be stored at -80℃ for 10 days.)

3. เซลล์ ตัวอย่าง

Harvesting cell should not less than 106,then wash it with PBS for twice (re-suspend cell with PBS, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 600 ×กรัม สำหรับ 10 นาที). The volume of Reagent I added is three times the volume of cell precipitation to re-suspend the cells. Repeated freezing and thawing 2–3 times (It is suggested that frozen in liquid nitrogen, dissolved in 37℃ water bath). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาที, take the supernatant and place it at 4℃ for test. (If the test cannot be completed temporarily, the supernatant can be stored at -80℃ for 10 days.)

ครั้งที่สอง. ขั้นตอน

1. เปิดเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลทสำหรับ 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 412 นาโนเมตร, ตั้งค่าศูนย์ด้วยการกลั่น
2. Preheat Reagent II in 37℃ (mammal cell) หรือ 25 ℃ (สายพันธุ์อื่น) water bath for 30
3. Blank tube determination: take micro glass cuvette, เพิ่ม 20 น้ำกลั่น ไมโครลิตร, 140 μL ของรีเอเจนต์ II, 40 μL of Reagent III in turn, ผสมให้เข้ากัน, place for 2 นาที, and measure 412 nm absorbance AB.
4. Making standard curve

Weigh 1 mg of standard and dissolve it with 1 mL of distilled water to obtain the concentration of 1 มก./มล. Take the appropriate solution to prepare the standards with the concentration of 200 มก./มล, 100 มก./มล, 50 มก./มล, 25 μg/mL and 12.5 มก./มล (Dilute Reagent I ten times before diluting the standard solution).

Take a 1.5 mL EP tube and add 20 μL of standard, 140 μL of Reagent II and 40 μL of Reagent III in turn. After each tube is evenly mixed, it is allowed to stand for 2 นาที. วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 412 นาโนเมตร, and absorbance minus AB as abscissa. Make the standard curve according to the absorbance (x) and concentration (ย, มก./มล).

5. Sample tube test: take micro glass cuvette, เพิ่ม 20 μL of sample, 140 μL ของรีเอเจนต์ II, 40 μL of Reagent III in turn, ผสมให้เข้ากัน, and then stand for 2 minutes to test the absorbance ATat 412 นาโนเมตร, ∆A = AT – เอบี.
6. The operation of the microplate reader is the same as that of the spectrophotometer, and the operation is as fast as

สาม. Calculations

According to the standard curve, take sample ΔA into the formula(x), and calculate the sample concentration y (มก./มล).

• ความเข้มข้นของโปรตีน

จีเอสเอช (ไมโครกรัม/มิลลิกรัมโปรต)=y×VRV÷VRV÷Cpr =y÷Cpr

• น้ำหนักตัวอย่าง

จีเอสเอช (μg/g)=y×VRV÷(VRV÷VSV×W)= y÷W

• จำนวนเซลล์

จีเอสเอช (μg/104cell)=y×VRV÷(VRV÷VSV×N)= y÷N

• Solution volume GSH (มก./มล)=2y

เอ็น: จำนวนเซลล์, 106;

VSV: Total supernatant volume, 1 มล；

VRV: Supernatant volume added into the reaction system, 20 μL=0.02 mL； ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก;

ซีพีอาร์: Supernatant protein concentration, มก./มล.

2: The volume of plasma (blood cells) is diluted by one time.

บันทึก:

1. The sample needs to be homogenized completely. If the test cannot be completed temporarily, it can be stored at-80℃.
2. มาตรฐาน: Reduced glutathione is prepared when the solution will be
3. If the GSH content in the sample is uncertain, Dilute the sample for several gradients before
4. Because Reagent I contain protein precipitant, the supernatant cannot be used for protein concentration determination. If the protein content needs to be determined, take another tissue.

Reference:

• Alpert A J, Gilbert H F. Detection of oxidized and reduced glutathione with a recycling postcolumn reaction[เจ]. Analytical biochemistry, 1985, 144(2):553-562.
• Owens C W I, Belcher R V. A colorimetric micro-method for the determination of glutathione[เจ]. Biochemical Journal, 1965, 94(3):

สินค้าที่เกี่ยวข้อง：

BC1180/ BC1185 Oxidized Glutathione（GSSG）Assay Kit

BC1190/ BC1195 Glutathione Peroxidase Assay Kit

BC1150/ BC1155 Oxidized Thioredoxin Reductase (TrxR) ชุดทดสอบ

BC1210/ BC1215 γ-glutamate-cysteine ligase (GCL) Assay Ki