Solarbio ลดกลูตาไธโอน (จีเอสเอช) ชุดทดสอบเนื้อหา

Reduced Glutathione (จีเอสเอช) ชุดทดสอบเนื้อหา

บันทึก: ใช้ตัวอย่างที่แตกต่างกันสองหรือสามตัวอย่างเพื่อทำนายก่อนการทดสอบ.

อุปกรณ์การดำเนินงาน: เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลท

หมายเลขแค็ตตาล็อก: BC1175

ขนาด: 100ที/96ส

ส่วนประกอบ:

รีเอเจนต์ I: 100 มล.×1. เก็บที่อุณหภูมิ 4 ℃.

รีเอเจนต์ II: 20 มล.×1. เก็บที่อุณหภูมิ 4 ℃.

รีเอเจนต์ III: 8 มล.×1. เก็บที่อุณหภูมิ 4 ℃, protect from light.

มาตรฐาน: ผง 10 มก.×1. เก็บที่อุณหภูมิ 4 ℃, protect from light.

รายละเอียดสินค้า

Glutathione is a natural tripeptide composed of glutamic acid (กลู), cysteine (ซิส) and glycine (Gly). It is a kind of compound containing sulfhydryl group (-SH), which widely exists in animal tissue, เนื้อเยื่อพืช, microorganism, and yeast. Glutathione can react with 5,5′-dithiobis-(2-กรดไนโตรเบนโซอิก) (ดีทีเอ็นบี) to produce 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid and glutathione disulfide (จีเอสเอสจี). 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid is a yellow product, with the maximum absorption at 412 นาโนเมตร.

ข้อกำหนดทางเทคนิค

ขีดจำกัดการตรวจจับขั้นต่ำ：3.763 มก./มล

ช่วงเชิงเส้น：12.5-400 มก./มล

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้

ความสมดุลเชิงวิเคราะห์, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, เครื่องหมุนเหวี่ยงอุณหภูมิต่ำ, อ่างอาบน้ำ, ปิเปตแบบปรับได้, เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลท, micro glass cuvette or 96 well flat-bottom plate and distilled water.

ขั้นตอน

ฉัน. การจัดเตรียมตัวอย่าง

1. ตัวอย่างเนื้อเยื่อ

ล้างทิชชู่สดด้วย PBS สองครั้ง, จากนั้นเพิ่ม 0.1 g of animal/plant tissue into homogenizer (โฮโมจีไนเซอร์ถูกล้างด้วยรีเอเจนต์ I แล้ววางบนน้ำแข็งก่อนใช้งาน). เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของรีเอเจนต์ I (the proportion of tissue and Reagents can be kept constant), บดน้ำแข็งจนสุด (การใช้ไนโตรเจนเหลวจะมีผลการบดที่ดีกว่า). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃, นำส่วนเหนือตะกอนมาวางไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃เพื่อทำการทดสอบ. (หากไม่สามารถทำการทดสอบให้แล้วเสร็จได้ชั่วคราว, the supernatant can be stored at -80℃ for 10 วัน)

2. ตัวอย่างเลือด

พลาสมา: ตัวอย่างถูกปั่นเหวี่ยงที่ 600 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃. Absorbing the upper plasma into another tube with adding the same volume Reagent I. เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃, take the supernatant and place it at 4℃for test. (หากไม่สามารถทำการทดสอบให้แล้วเสร็จได้ชั่วคราว, the supernatant can be stored at -80℃ for 10 วัน)

เซลล์เม็ดเลือด: ตัวอย่างถูกปั่นเหวี่ยงที่ 600 ×กรัม สำหรับ 10 minutes at 4℃. การทิ้งพลาสมาส่วนบน, wash with three times volume of PBS for 3 ครั้ง (re-suspend blood cell with PBS, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 600 ×กรัม สำหรับ 10 นาที), เพิ่มปริมาตรรีเอเจนต์ I ที่เท่ากัน. หลังจากผสมแล้ว, วางไว้ที่ 4 ℃สำหรับ 10 นาที. เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาที, นำส่วนเหนือตะกอนมาวางไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃เพื่อทำการทดสอบ. (หากไม่สามารถทำการทดสอบให้แล้วเสร็จได้ชั่วคราว, the supernatant can be stored at -80℃ for 10 วัน)

3. เซลล์ ตัวอย่าง

Harvesting cell should not less than 106,then wash it with PBS for twice (re-suspend cell with PBS, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 600 ×กรัม สำหรับ 10 นาที). The volume of Reagent I added is three times the volume of cell precipitation to re-suspend the cells. การแช่แข็งและละลายซ้ำ 2-3 ครั้ง (It is suggested that frozen in liquid nitrogen, ละลายในอ่างน้ำอุณหภูมิ 37°C). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาที, นำส่วนเหนือตะกอนมาวางไว้ที่อุณหภูมิ 4 ℃เพื่อทำการทดสอบ. (หากไม่สามารถทำการทดสอบให้แล้วเสร็จได้ชั่วคราว, the supernatant can be stored at -80℃ for 10 วัน)

ครั้งที่สอง. ขั้นตอน

1. เปิดเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์/เครื่องอ่านไมโครเพลทสำหรับ 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 412 นาโนเมตร, ตั้งค่าศูนย์ด้วยการกลั่น
2. Preheat Reagent II in 37℃ (เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) หรือ 25 ℃ (สายพันธุ์อื่น) water bath for 30
3. Blank tube determination: take micro glass cuvette, เพิ่ม 20 น้ำกลั่น ไมโครลิตร, 140 μL ของรีเอเจนต์ II, 40 μL of Reagent III in turn, ผสมให้เข้ากัน, place for 2 นาที, and measure 412 nm absorbance AB.
4. Making standard curve

Weigh 1 mg of standard and dissolve it with 1 mL of distilled water to obtain the concentration of 1 มก./มล. Take the appropriate solution to prepare the standards with the concentration of 200 มก./มล, 100 มก./มล, 50 มก./มล, 25 μg/mL and 12.5 มก./มล (Dilute Reagent I ten times before diluting the standard solution).

Take a 1.5 mL EP tube and add 20 μL of standard, 140 μL of Reagent II and 40 μL of Reagent III in turn. After each tube is evenly mixed, it is allowed to stand for 2 นาที. วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 412 นาโนเมตร, and absorbance minus AB as abscissa. Make the standard curve according to the absorbance (x) and concentration (ย, มก./มล).

5. Sample tube test: take micro glass cuvette, เพิ่ม 20 μL of sample, 140 μL ของรีเอเจนต์ II, 40 μL of Reagent III in turn, ผสมให้เข้ากัน, and then stand for 2 minutes to test the absorbance ATat 412 นาโนเมตร, ∆A = AT – เอบี.
6. The operation of the microplate reader is the same as that of the spectrophotometer, and the operation is as fast as

สาม. การคำนวณ

ตามเส้นโค้งมาตรฐาน, take sample ΔA into the formula(x), and calculate the sample concentration y (มก./มล).

• ความเข้มข้นของโปรตีน

จีเอสเอช (ไมโครกรัม/มิลลิกรัมโปรต)=y×VRV÷VRV÷Cpr =y÷Cpr

• น้ำหนักตัวอย่าง

จีเอสเอช (μg/g)=y×VRV÷(VRV÷VSV×W)= y۞W

• จำนวนเซลล์

จีเอสเอช (μg/104cell)=y×VRV÷(VRV÷VSV×N)= y۞N

• Solution volume GSH (มก./มล)=2y

เอ็น: จำนวนเซลล์, 106;

VSV: Total supernatant volume, 1 มล；

VRV: Supernatant volume added into the reaction system, 20 ไมโครลิตร=0.02 มล； ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก;

ซีพีอาร์: ความเข้มข้นของโปรตีนเหนือตะกอน, มก./มล.

2: The volume of plasma (blood cells) is diluted by one time.

บันทึก:

1. ตัวอย่างจะต้องทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยสมบูรณ์. หากไม่สามารถทำการทดสอบให้แล้วเสร็จได้ชั่วคราว, สามารถเก็บไว้ที่ -80 ℃.
2. มาตรฐาน: Reduced glutathione is prepared when the solution will be
3. If the GSH content in the sample is uncertain, Dilute the sample for several gradients before
4. Because Reagent I contain protein precipitant, the supernatant cannot be used for protein concentration determination. หากจำเป็นต้องกำหนดปริมาณโปรตีน, เอาเนื้อเยื่ออีกอัน.

อ้างอิง:

• อัลเพิร์ต เอ เจ, กิลเบิร์ต เอช เอฟ. การตรวจหากลูตาไธโอนที่ถูกออกซิไดซ์และรีดิวซ์ด้วยปฏิกิริยาหลังการรีไซเคิล[เจ]. ชีวเคมีวิเคราะห์, 1985, 144(2):553-562.
• โอเวนส์ ซี ดับเบิลยู ไอ, Belcher R V. A colorimetric micro-method for the determination of glutathione[เจ]. วารสารชีวเคมี, 1965, 94(3):

สินค้าที่เกี่ยวข้อง：

BC1180/ BC1185 Oxidized Glutathione（GSSG）Assay Kit

BC1190/ BC1195 ชุดทดสอบกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส

BC1150/ BC1155 Oxidized Thioredoxin Reductase (TrxR) ชุดทดสอบ

BC1210/ BC1215 γ-glutamate-cysteine ligase (GCL) Assay Ki