Stool Total RNA Extraction Kit

1. ส่วนประกอบของชุดรีเอเจนต์

2. พื้นที่จัดเก็บ

ชุดรีเอเจนต์นี้ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง (15-25องศาเซลเซียส) under dry conditions and can be kept for 12 เดือน. Lysozyme and Proteinase K contain preservatives, allowing for transportation at room temperature. เพื่อการเก็บรักษาในระยะยาว, it should be stored at -20°C.

3. คำแนะนำในการใช้ชุดรีเอเจนต์

3.1 ชุดนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยอณูชีววิทยา และไม่ควรใช้สำหรับการวินิจฉัยหรือการรักษาโรค.

3.2 ส่วนประกอบบางอย่างในชุดมีสารระคายเคือง; ขอแนะนำให้ใช้ความระมัดระวังที่จำเป็น (เช่น การสวมชุดป้องกันและแว่นตา).

3.3 การใช้ชุดอุปกรณ์นี้ต้องใช้อุปกรณ์เพิ่มเติม เช่น เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง, อ่างอาบน้ำ (อาบน้ำโลหะ), เครื่องผสมน้ำวน, เอทานอลปราศจากน้ำ, ไนโตรเจนเหลว, คลอโรฟอร์ม, น้ำปราศจากไอออนฆ่าเชื้อ, และท่ออีพี.

4. ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับชุดรีเอเจนต์

The Fecal Total RNA Purification Kit provides a fast and efficient method for purifying total RNA from feces and vomit, widely applicable to the extraction of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, and viral RNA in feces and vomit samples.

This kit effectively removes impurities and inhibitors from feces and vomit, reducing inhibition in subsequent downstream experiments such as พีซีอาร์. The extracted RNA can be directly used for PCR, การซับใต้, ฯลฯ. The entire purification process does not require toxic reagents such as phenol-chloroform, making the RNA purification kit suitable for various other sample types.

5. หลักและวิธีการทดลอง

6. กระบวนการสกัด

ข้อควรระวังก่อนเริ่มการทดลอง:

ก. ก่อนใช้งาน, add the specified amount of anhydrous ethanol to ล้างกันชน 1 as indicated on the reagent bottle label, and mark with a check on the label to indicate the addition of anhydrous ethanol.

บี. บัฟเฟอร์การชะล้างคือ 0.1x โซลูชัน TE containing a minimal amount of EDTA. หาก EDTA อาจส่งผลต่อการทดลองครั้งต่อไป, it is recommended to substitute Elution Buffer with sterile deionized water.

1. การประมวลผลตัวอย่าง (Inhibitor Removal):

ก: Add approximately 200mg of samples such as feces, add 1ml of Humic Acid Removal Reagent I, vortex thoroughly for 1-2 นาที, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 2 นาที, and discard the supernatant.

บี: If the extracted sample is a virus sample, you can proceed directly to step 2. If the sample contains a high amount of inhibitors, it is recommended to perform the inhibitor removal step first, although it may reduce the yield of viral nucleic acid.

2. Sample Lysis:

ก: For extracting nucleic acids from bacterial samples, เพิ่ม 560μl of Buffer C Plus, 20μl Proteinase K, and 20μl Lysozyme to the centrifuge tube from the previous step. Invert and mix thoroughly, digest at 85℃ for 5 นาที, inverting the tube 6-7 times during digestion.

บี: For extracting nucleic acids from virus samples, เพิ่ม 560μl of Buffer C Plus and 20μl Proteinase K. Digest at 85℃ for 5 นาที, inverting the tube 6-7 times during digestion.

3. เครื่องปั่นแยกที่ 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาที, transfer the supernatant to a new centrifuge tube (approximately 500μl liquid transferred).
4. Add an equal volume of anhydrous ethanol, mix thoroughly. Precipitation may occur, แต่ไม่ส่งผลต่อการทดลองครั้งต่อๆ ไป.
5. ถ่ายโอนของเหลวที่ได้รับไปยังคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA (approximately 650-700μl each time), ฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 นาที, ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะที่รวบรวมไว้, และใส่ท่อรวบรวมกลับเข้าไปในคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์สำหรับขั้นตอนต่อไป.
6. Place the RNA purification column into a new collection tube, เพิ่ม 400μl ของบัฟเฟอร์การกำจัดสารยับยั้ง, ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะ, and place the nucleic acid purification column back into the tube for the next step.
7. เพิ่ม 500μl ของ Wash Buffer 1ไปยังคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 14,000 รอบต่อนาที (20,00×ก) สำหรับ 2 นาที, extending the centrifugation time as needed to ensure membrane drying.

(บันทึก: การมีอยู่ของเอทานอลมีผลกระทบร้ายแรงต่อการทดลองครั้งต่อไป, so membrane drying is crucial. หลังจากการปั่นแยก, ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีเอทานอลอยู่ก่อนทำการชะล้าง, แล้วทิ้งขยะและท่อรวบรวม.)

8. Place the RNA purification column into a new centrifuge tube, เพิ่ม 30ไมโครลิตร – 50 μl ของบัฟเฟอร์การชะล้างto the membrane, ฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที (15℃-25℃), ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที.

(บันทึก: Using 30μl of Elution Buffer to elute RNA can increase RNA concentration but may reduce total RNA yield.)

9. ทำซ้ำขั้นตอนก่อนหน้า.

(บันทึก: A new centrifuge tube can be used to collect the RNA eluted in the second wash or continue using the original collection tube to collect RNA.)