- ส่วนประกอบของชุดรีเอเจนต์
| ข้อมูลจำเพาะ | 50ต | 100ต |
| แมว. เลขที่. | SN0303 | SN0304 |
| คอลัมน์การแยก RNA (ชุด) | 50 (ชุด) | 100 (ชุด) |
| ดีเนส ไอ | 1มล | 1มล |
| 10 × บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา | 1 มล | 2 ×1มล |
| บัฟเฟอร์ไตรโซล | 50 มล | 2 × 50 มล |
| บัฟเฟอร์การกำจัดสารยับยั้ง | 30 มล | 2 × 30 มล |
| ล้างบัฟเฟอร์ 1 | 15 มล | 2 × 15 มล |
| บัฟเฟอร์การชะล้าง | 20 มล | 2 ×20 มล |
| คู่มือการใช้งาน | 1 | 1 |
- พื้นที่จัดเก็บ
ชุดรีเอเจนต์นี้ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง (15-25℃) ในสภาพแวดล้อมที่แห้งและมีความเสถียรสำหรับ 12 เดือน. DNase I มีสารกันบูด, จึงสามารถขนส่งได้ที่อุณหภูมิห้อง, แต่สำหรับการจัดเก็บระยะยาว, ควรเก็บไว้ที่ -20 ℃.
- คำแนะนำในการใช้ชุดรีเอเจนต์
3.1 ชุดนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยอณูชีววิทยา และไม่ควรใช้สำหรับการวินิจฉัยหรือการรักษาโรค.
3.2 ส่วนประกอบบางอย่างในชุดมีสารระคายเคือง; ขอแนะนำให้ใช้ความระมัดระวังที่จำเป็น (เช่น การสวมชุดป้องกันและแว่นตา).
3.3 การใช้ชุดอุปกรณ์นี้ต้องใช้อุปกรณ์เพิ่มเติม เช่น เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง, อ่างอาบน้ำ (อาบน้ำโลหะ), เครื่องผสมน้ำวน, เอทานอลปราศจากน้ำ, ไนโตรเจนเหลว, คลอโรฟอร์ม, น้ำปราศจากไอออนฆ่าเชื้อ, และท่ออีพี.
- ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับชุดรีเอเจนต์
ชุดการทำให้บริสุทธิ์ RNA นี้ใช้ TRIzol แบบดั้งเดิมรวมกับวิธีเมมเบรนแบบคอลัมน์เพื่อทำให้พืชบริสุทธิ์อย่างรวดเร็ว, สัตว์, เนื้อเยื่อ, เซลล์, จุลินทรีย์อาร์เอ็นเอ, และเส้นใยอาร์เอ็นเอของเชื้อรา. เหมาะสำหรับสายพันธุ์ส่วนใหญ่. ชุดการทำให้บริสุทธิ์ RNA นี้สามารถนำไปใช้กับเนื้อเยื่อพืชเกิน 100 มก. RNA ที่สกัดด้วยชุดอุปกรณ์นี้มีปริมาณ DNA ต่ำมาก. หากความไวต่อ DNA ในการทดลองเป็นเรื่องที่น่ากังวล, ขอแนะนำให้ใช้การย่อย DNase I บนคอลัมน์.
ชุด RNA Fast Purification Kit สามารถแยก RNA ทั้งหมดจากตัวอย่างได้ (รวมถึงนิวเคลียร์ RNA และไซโตพลาสซึม RNA) ภายใน 1 ชั่วโมง. RNA ที่แยกออกมาสามารถนำมาใช้กับ RT ได้โดยตรง-พีซีอาร์, การซับภาคเหนือ, และแอพพลิเคชั่นอื่น ๆ.
- หลักและวิธีการทดลอง
- กระบวนการสกัด
ข้อควรระวังก่อนเริ่มการทดลอง:
ก. ก่อนใช้งาน, เติมเอทานอลสัมบูรณ์ตามจำนวนที่ระบุลงไป ล้างกันชน 1 ตามฉลากบนขวดรีเอเจนต์, และทำเครื่องหมายในช่องบนฉลากเพื่อระบุว่าได้เติมเอธานอลสัมบูรณ์แล้ว.
บี. บัฟเฟอร์การชะล้างคือ 0.1x โซลูชัน TE ที่มี EDTA น้อยที่สุด. หาก EDTA ส่งผลต่อการทดลองครั้งต่อไป, ขอแนะนำให้เปลี่ยน Elution Buffer ด้วยน้ำปราศจากไอออนที่ปราศจากไอออน.
- การประมวลผลตัวอย่าง:
ก. เนื้อเยื่อ: หากวัตถุดิบสดไม่สามารถนำมาใช้ได้ทันที, ใส่ไว้ในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80°C. วัสดุแห้งสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องได้. บดเนื้อเยื่อ 30~80 มก. ในไนโตรเจนเหลวแล้วเติมลงไป 1 มล. บัฟเฟอร์ Trizol เพื่อทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน.
บี. เซลล์เพาะเลี้ยงชั้นเดียว: ดูดอาหารเลี้ยงเชื้อแล้วเติม 1 มล. บัฟเฟอร์ Trizol เพื่อทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน.
ค. การระงับเซลล์: ปั่นแยกเพื่อรวบรวมเซลล์และเพิ่ม 1 มล. บัฟเฟอร์ Trizol เพื่อทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน.
2. หลังจากเพิ่ม บัฟเฟอร์ไตรโซล ไปที่ตัวอย่าง, ผสมให้เข้ากันโดยการปิเปต, อนุญาตให้สลายตัวอย่างได้อย่างสมบูรณ์, และฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที.
3. เติมคลอโรฟอร์มในอัตราส่วน 200 ไมโครลิตรต่อ 1 บัฟเฟอร์ Trizol มล, เขย่าอย่างแรงเพื่อ 30 วินาที, และฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 นาที.
4. ปั่นแยกไลซีนที่ 4°C, 12,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 10 นาที. RNA จะอยู่ในระยะบนของน้ำ.
5. ถ่ายเทส่วนลอยเหนือตะกอนไปยังหลอดหมุนเหวี่ยงใหม่อย่างระมัดระวัง, หลีกเลี่ยงการสะสมของชั้นกลางและชั้นล่าง. (บันทึก: ประมาณ 400 สามารถถ่ายโอนของเหลว µl ได้, ซึ่งอาจจะน้อยสำหรับบางสายพันธุ์.)
6. เติมเอทานอลสัมบูรณ์แช่เย็นล่วงหน้าในปริมาณเท่ากัน, ผสมอย่างรวดเร็ว. (ตัวอย่างเช่น, เพิ่ม 400 ไมโครลิตรของไลเซต, เพิ่ม 400 ไมโครลิตรของเอทานอลสัมบูรณ์. หากปริมาตรไลซีนน้อยกว่า 400 ไมโครลิตร, ลดปริมาณเอทานอลสัมบูรณ์ตามสัดส่วน. อาจเกิดการตกตะกอนเล็กน้อยหลังจากเติมเอทานอล, แต่ไม่ส่งผลต่อการทดลองครั้งต่อๆ ไป.)
7. ถ่ายโอนของเหลวที่ได้รับไปยังคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA (ประมาณ 650-700 ไมโครลิตรต่อครั้ง), ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะที่รวบรวมไว้, และใส่ท่อรวบรวมกลับเข้าไปในคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์สำหรับขั้นตอนต่อไป.
8. ทำซ้ำขั้นตอน 7, เติมของเหลวที่เหลือลงในคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA, ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะและท่อรวบรวม.
9. วางคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA ลงในหลอดรวบรวมใหม่, เพิ่ม 300 μl ของบัฟเฟอร์การกำจัดสารยับยั้ง, ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะ, และใส่คอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA เข้าไปในหลอดอีกครั้งสำหรับขั้นตอนต่อไป.
10. เพิ่ม 80 ไมโครลิตรของ DNase Iวิธีแก้ปัญหาการทำงานของคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA, ฟักที่อุณหภูมิ 20°C ถึง 30°C สำหรับ 15 นาที. (เตรียมโซลูชันการทำงานของ DNase I: 62 μl น้ำปราศจาก RNase, 8 μl 10× บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา, และ 10 μl DNase I, ทำขึ้นเพื่อ 80 μl DNase ฉันทำงานวิธีแก้ปัญหา.)
11. เพิ่ม 300 μl ของบัฟเฟอร์การกำจัดสารยับยั้งไปยังคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA, ปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที, ทิ้งขยะ, และใส่คอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA เข้าไปในหลอดอีกครั้งสำหรับขั้นตอนต่อไป.
12. เพิ่ม 700 μl ของ Wash Buffer 1ไปยังคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA, เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 14,000 รอบต่อนาที (20,000×ก) สำหรับ 2 นาที, ขยายเวลาการปั่นเหวี่ยงหากจำเป็นสำหรับเมมเบรนแห้ง. (บันทึก: ยืนยันการเติมเอธานอลลงใน Wash Buffer 1; การมีเอทานอลส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการทดลองครั้งต่อไป. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเมมเบรนแห้งหลังจากการปั่นแยกก่อนทำการชะล้าง. ทิ้งของเสียและท่อรวบรวม. หลังจากใช้ Wash Buffer 1, เมมเบรนบนคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA ควรมีสีเพียงเล็กน้อยเท่านั้น. นำคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA ออกอย่างระมัดระวังหลังการหมุนเหวี่ยง, ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่ได้สัมผัสท่อรวบรวมเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนเอทานอล.)
13. วางคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์ RNA ลงในหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงหลอดใหม่, หยด 100 μl ของบัฟเฟอร์การชะล้างลงบนเมมเบรน, ฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที (15°ซ ถึง 25°ซ), และปั่นแยกที่มากกว่า 8,000 รอบต่อนาทีสำหรับ 1 นาที. (บันทึก: การชะล้าง RNA ด้วย 50 μl ของ Elution Buffer สามารถเพิ่มความเข้มข้นของ RNA แต่ลดผลผลิต RNA ทั้งหมด.)
14. ทำซ้ำขั้นตอนก่อนหน้า. (บันทึก: สามารถใช้หลอดหมุนเหวี่ยงใหม่เพื่อรวบรวม RNA ที่ชะออกมาเป็นครั้งที่สอง หรือใช้หลอดรวบรวมเดิมเพื่อรวบรวม RNA ต่อไป.)
รีวิว
ยังไม่มีบทวิจารณ์