ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (พีซีอาร์) เป็นเครื่องมือสำคัญในอณูชีววิทยาและการวินิจฉัย. หัวใจสำคัญของปฏิกิริยา PCR ทุกครั้งคือส่วนผสมหลัก – ค็อกเทลที่ทำไว้ล่วงหน้าที่มีส่วนผสมสำคัญทั้งหมดสำหรับการขยาย DNA. แต่สิ่งที่รวมอยู่ในองค์ประกอบ PCR ที่สำคัญนี้คืออะไร? และสิ่งที่ควรพิจารณาในการกำหนดส่วนผสมหลักที่สมบูรณ์แบบสำหรับการทดลองของคุณ? คู่มือฉบับสมบูรณ์นี้จะแจกแจงรายละเอียดทั้งหมดในรูปแบบง่ายๆ.
PCR Master Mix คืออะไร?
ก ส่วนผสมหลัก PCR เป็นพรีมิกซ์, สารละลายพร้อมใช้ที่มีส่วนประกอบที่จำเป็นทั้งหมดสำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ยกเว้นเทมเพลต DNA และไพรเมอร์. โดยทั่วไปจะประกอบด้วย:
- เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส
- ดีออกซีนิวคลีโอไทด์ (dNTP)
- บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา
- แมกนีเซียมคลอไรด์
- สารเพิ่มความคงตัวและสารเพิ่มประสิทธิภาพ
โดยการเตรียมส่วนผสมหลัก, คุณสามารถแบ่งส่วนสูตรที่ได้รับการปรับปรุงเดียวกันนี้ลงในหลอดปฏิกิริยาหรือหลุมหลายช่องในจานเดียวได้. ซึ่งช่วยประหยัดเวลา, ลดข้อผิดพลาด, และเพิ่มความสม่ำเสมอเมื่อเปรียบเทียบกับการเพิ่มส่วนประกอบแต่ละส่วนลงในแต่ละปฏิกิริยา.
มาสเตอร์มิกซ์เป็นตัวเปลี่ยนเกม PCR, เปิดใช้งานการตั้งค่าการทดสอบปริมาณงานสูงที่เรียบง่าย. ไม่ว่าคุณจะทำ PCR ตามปกติหรือวิเคราะห์ตัวอย่างนับพันตัวอย่าง, มิกซ์หลักช่วยให้ขั้นตอนการทำงานคล่องตัวขึ้น.
PCR Master Mixes มีกี่ประเภท?
มีผลิตภัณฑ์ผสมหลักจำนวนมากที่ได้รับการปรับแต่งให้เหมาะกับการใช้งาน PCR ประเภทต่างๆ:
- PCR มาตรฐาน –สำหรับการขยาย DNA เป็นประจำ. ประกอบด้วยโพลีเมอเรสที่ไม่มีการพิสูจน์อักษร.
- PCR ความเที่ยงตรงสูง– ใช้โพลีเมอเรสพิสูจน์อักษรสำหรับการโคลน, การเรียงลำดับ, หรือการใช้งานที่ต้องการความแม่นยำสูง.
- มัลติเพล็กซ์ PCR – ประกอบด้วยไพรเมอร์ที่สมดุลเพื่อขยายหลายเป้าหมายร่วมในปฏิกิริยาเดียว.
- qPCR แบบเรียลไทม์ – รวมถึงผู้รายงานเรืองแสง เช่น โพรบหรือสีย้อม DNA สำหรับการวัดปริมาณ.
- RT-PCR – ประกอบด้วยเอนไซม์ Reverse Transcriptase สำหรับขยายเทมเพลต RNA.
- PCR สตาร์ทร้อน – ใช้โพลีเมอเรสที่กระตุ้นด้วยความร้อนซึ่งถูกบล็อกด้วยสารยับยั้งเพื่อปรับปรุงความจำเพาะโดยการลดผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณปลอม.
- PCR ปั่นจักรยานเร็ว – เปิดใช้งานโปรโตคอลเทอร์โมไซคลิงที่รวดเร็วเพื่อเพิ่มปริมาณงาน.
มาสเตอร์มิกซ์หลายรายการยังได้รับการปรับให้เหมาะสมล่วงหน้าสำหรับการใช้งานกับเครื่องมือ PCR บางชนิดหรือสารเคมีในการตรวจจับ เช่น โพรบ TaqMan. ดังนั้นให้จับคู่มิกซ์พิเศษกับโปรโตคอล PCR เฉพาะของคุณ, เป้าหมาย, และแพลตฟอร์มเพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด.
qPCR Master Mix สำหรับการทดลองแบบเรียลไทม์
สำหรับ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (คิวพีซีอาร์) การทดลอง, ส่วนผสมหลัก qPCR เฉพาะทางประกอบด้วยโพรบที่ติดฉลากเรืองแสงหรือสีย้อมจับ DNA เพื่อให้สามารถตรวจจับและกำหนดปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR เมื่อสะสมอยู่ใน “เรียลไทม์” ระหว่างการเทอร์โมไซเคิล.
ประเภทมิกซ์ต้นแบบ qPCR แบบเรียลไทม์ทั่วไปบางประเภทประกอบด้วย:
- ซีบีอาร์ สีเขียว – สีย้อมแบบอินเทอร์คาเลตติ้งที่เรืองแสงเมื่อจับกับดีเอ็นเอที่มีเกลียวคู่.
- โพรบ TaqMan – หัววัดฟลูออโรฟอร์-ดับเชอร์ถูกแยกออกระหว่างการขยายสัญญาณ.
- สัญญาณโมเลกุล – โพรบกิ๊บติดผมเรืองแสงพร้อมตัวดับเพื่อลดพื้นหลัง.
- โพรบการผสมพันธุ์ – โพรบที่อยู่ติดกันที่ใช้ FRET สำหรับการสร้างสัญญาณ.
การใช้ส่วนผสมหลักที่กำหนดสูตรและปรับให้เหมาะสมสำหรับเคมีการตรวจจับ qPCR เฉพาะของคุณ ช่วยลดความยุ่งยากในการตั้งค่าปฏิกิริยาและให้ความน่าเชื่อถือ, ผลลัพธ์ที่ละเอียดอ่อน.
วิธีสร้าง PCR Master Mix?
ในขณะที่ผลิตภัณฑ์ผสมหลักเชิงพาณิชย์คุณภาพสูงมีจำหน่ายอย่างแพร่หลาย, คุณยังสามารถสร้างมิกซ์หลัก PCR แบบกำหนดเองได้ ต่อไปนี้เป็นขั้นตอนสำคัญที่เกี่ยวข้อง:
1. เลือกเอนไซม์ DNA polymerase
นี่เป็นองค์ประกอบที่สำคัญที่สุดที่กระตุ้นการขยาย DNA. ตัวเลือกยอดนิยม ได้แก่ Taq, ฟู่, คำถามที่ 5, แรงผลักดัน, รหัส, ทีธ. พิจารณากระบวนการ, ความแม่นยำ, อัตราการขยาย, และความเข้ากันได้กับบัฟเฟอร์ PCR เมื่อเลือกเอนไซม์.
2. เตรียมบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา PCR ที่ปรับให้เหมาะสม
บัฟเฟอร์ให้ค่า pH ที่เหมาะสม, ความเข้มข้นของเกลือ, และความเข้ากันได้ของปัจจัยร่วมสำหรับกิจกรรมโพลีเมอเรส. ส่วนประกอบทั่วไปได้แก่:
- ทริส-HCl ค่า pH 8.5 – รักษา pH เป็นกลางที่อุณหภูมิส่วนขยาย
- เคซีแอลหรือ (NH4)2SO4 – แคตไอออนเดี่ยวสำหรับการนำไฟฟ้า
- MgCl2 – โคแฟกเตอร์แคตไอออนไดเวเลนต์ที่จำเป็นสำหรับโพลีเมอเรส
- สารเพิ่มประสิทธิภาพ PCR – เบทาอีน, ดีเอ็มเอสโอ, สารเพิ่มความคงตัวเช่น BSA
3. เพิ่มดีออกซีนิวคลีโอไทด์ที่สมดุล (dNTP)
ใช้การผสมผสานที่เท่ากันของ dATP, ดีซีทีพี, ดีจีทีพี, ดีทีพี. ความเข้มข้นมาตรฐานคือ 100-200 μM แต่ละตัว ดีเอ็นทีพี.
4. รวมปัจจัยร่วมที่จำเป็น
แมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) เป็นปัจจัยร่วมที่สำคัญสำหรับกิจกรรมและความจำเพาะของโพลีเมอเรส. รวมไว้ที่ 1-5 ความเข้มข้นสุดท้าย mM.
5. เพิ่มความคงตัว
ผงซักฟอกที่ไม่มีไอออนิก, ดีทีที, ทรีฮาโลส, ฯลฯ. ช่วยรักษากิจกรรมของโพลีเมอเรสระหว่างการเก็บรักษา.
6. ปรับความเข้มข้นของส่วนประกอบ
เพื่อความสะดวก, ทำส่วนผสมหลัก 2X หรือ 4X แบบเข้มข้นโดยการเพิ่มจำนวนส่วนประกอบเป็นสองเท่าหรือสี่เท่า.
7. ผสมส่วนประกอบให้ละเอียดก่อนแบ่งส่วน
หมุนวนอย่างแรงหรือปิเปตซ้ำๆ เพื่อให้แน่ใจว่าส่วนผสมหลักเป็นเนื้อเดียวกัน.
8. สร้างส่วนลงตัวแบบใช้ครั้งเดียวสำหรับการจัดเก็บ
หลีกเลี่ยงวงจรการแช่แข็งและละลาย. เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด, เก็บแช่แข็งและละลายส่วนลงตัวบนน้ำแข็งก่อนใช้งาน.
เมื่อพัฒนาส่วนผสมหลักของคุณเป็นครั้งแรก, ปฏิบัติตามสูตรบัฟเฟอร์และความเข้มข้นของส่วนประกอบที่แนะนำโดยผู้ผลิตโพลีเมอเรสเป็นจุดเริ่มต้น.
ปรับความเข้มข้นให้เหมาะสมผ่านการทดสอบซ้ำเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพสูงสุด, ความจำเพาะ, ความไว, และความสม่ำเสมอสำหรับโปรโตคอล PCR เฉพาะของคุณ, อุปกรณ์, และการประยุกต์ใช้.
วิธีใช้ PCR Master Mix
การใช้ส่วนผสมหลัก PCR ในปฏิกิริยาของคุณไม่ใช่เรื่องง่ายอีกต่อไป. ต่อไปนี้เป็นภาพรวมสั้นๆ ทีละขั้นตอน:
- ละลาย – ปล่อยให้ส่วนผสมหลักที่แช่เย็นละลายบนน้ำแข็งจนหมด.
- กระแสน้ำวน – ผสมให้เข้ากันโดยการหมุนวนหรือการปิเปตขึ้นและลงเพื่อให้แน่ใจว่าเป็นเนื้อเดียวกันก่อนที่จะแบ่งส่วน.
- ส่วนลงตัว – จ่ายส่วนผสมหลักในปริมาณที่เหมาะสมต่อปฏิกิริยาลงในหลอด PCR หรือหลุมจานตามขนาดของปฏิกิริยา.
- เพิ่มไพรเมอร์ – ปิเปตไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับลงในแต่ละหลอดปฏิกิริยา/หลุม.
- เพิ่มเทมเพลต – เพิ่มตัวอย่าง DNA หรือเทมเพลตอื่นๆ ลงในแต่ละปฏิกิริยา.
- เติม – หากมีความจำเป็น, เติมน้ำเกรด PCR พิเศษเพื่อให้ได้ปริมาตรปฏิกิริยาที่ต้องการขั้นสุดท้าย.
- ผสม – ค่อยๆ ผสมน้ำวนหรือปิเปตเพื่อรวมส่วนประกอบทั้งหมดในแต่ละปฏิกิริยา.
- เครื่องหมุนเหวี่ยง – หมุนท่อ/แผ่นสั้นๆ เพื่อรวบรวมสิ่งที่อยู่ด้านล่าง.
- พีซีอาร์ – วางปฏิกิริยาในเครื่องหมุนเวียนความร้อน และเริ่มการทำงานของ PCR!
เมื่อใช้มาสเตอร์มิกซ์, เพิ่มเทมเพลต DNA ไว้ท้ายสุดเสมอ, หลังไพรเมอร์, เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้ามระหว่างปฏิกิริยา.
PCR Master Mix ช่วยเพิ่มพลังในการขยาย DNA ได้อย่างไร?
ส่วนผสมหลัก PCR มีส่วนผสมที่จำเป็นสำหรับการขยาย DNA ในรูปแบบที่พร้อมใช้งาน. การใช้ส่วนผสมหลักช่วยลดความยุ่งยากในการตั้งค่าปฏิกิริยา, ลดข้อผิดพลาด, และเพิ่มความสม่ำเสมอ.
มีส่วนผสมหลักที่ได้รับการปรับปรุงประสิทธิภาพประเภทต่างๆ สำหรับ PCR มาตรฐาน, คิวพีซีอาร์, PCR ความเที่ยงตรงสูง, RT-PCR, และอื่น ๆ. คุณยังสามารถสร้างมิกซ์ที่คุณกำหนดเองได้, แต่ผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์มีการทดสอบคุณภาพและความสะดวกสบายอย่างกว้างขวาง.
การทำความเข้าใจ PCR มาสเตอร์มิกซ์ช่วยให้มั่นใจได้ถึงผลลัพธ์ที่ประสบความสำเร็จสำหรับความต้องการด้านการขยายสัญญาณทั้งหมดของคุณ. ด้วยพลังของการผสมผสานหลักในชุดเครื่องมืออณูชีววิทยาของคุณ, การทดลอง DNA กลายเป็นเรื่องง่าย.
