PCR Master Mix คืออะไร? ผสม qPCR? คุณทำมันได้อย่างไร?

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (พีซีอาร์) เป็นเครื่องมือสำคัญในอณูชีววิทยาและการวินิจฉัย. At the heart of every PCR reaction is the master mix – a premade cocktail containing all the key ingredients for DNA amplification. แต่สิ่งที่รวมอยู่ในองค์ประกอบ PCR ที่สำคัญนี้คืออะไร? และสิ่งที่ควรพิจารณาในการกำหนดส่วนผสมหลักที่สมบูรณ์แบบสำหรับการทดลองของคุณ? คู่มือฉบับสมบูรณ์นี้จะแจกแจงรายละเอียดทั้งหมดในรูปแบบง่ายๆ.

PCR Master Mix คืออะไร?

ก ส่วนผสมหลัก PCR เป็นพรีมิกซ์, สารละลายพร้อมใช้ที่มีส่วนประกอบที่จำเป็นทั้งหมดสำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ยกเว้นเทมเพลต DNA และไพรเมอร์. โดยทั่วไปจะประกอบด้วย:

• เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส
• ดีออกซีนิวคลีโอไทด์ (dNTP)
• บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา
• แมกนีเซียมคลอไรด์
• สารเพิ่มความคงตัวและสารเพิ่มประสิทธิภาพ

โดยการเตรียมส่วนผสมหลัก, คุณสามารถแบ่งส่วนสูตรที่ได้รับการปรับปรุงเดียวกันนี้ลงในหลอดปฏิกิริยาหรือหลุมหลายช่องในจานเดียวได้. ซึ่งช่วยประหยัดเวลา, ลดข้อผิดพลาด, และเพิ่มความสม่ำเสมอเมื่อเปรียบเทียบกับการเพิ่มส่วนประกอบแต่ละส่วนลงในแต่ละปฏิกิริยา.

มาสเตอร์มิกซ์เป็นตัวเปลี่ยนเกม PCR, เปิดใช้งานการตั้งค่าการทดสอบปริมาณงานสูงที่เรียบง่าย. ไม่ว่าคุณจะทำ PCR ตามปกติหรือวิเคราะห์ตัวอย่างนับพันตัวอย่าง, มิกซ์หลักช่วยให้ขั้นตอนการทำงานคล่องตัวขึ้น.

PCR Master Mixes มีกี่ประเภท?

มีผลิตภัณฑ์ผสมหลักจำนวนมากที่ได้รับการปรับแต่งให้เหมาะกับการใช้งาน PCR ประเภทต่างๆ:

• Standard PCR –สำหรับการขยาย DNA เป็นประจำ. ประกอบด้วยโพลีเมอเรสที่ไม่มีการพิสูจน์อักษร.
• PCR ความเที่ยงตรงสูง– Uses proofreading polymerases for cloning, การเรียงลำดับ, หรือการใช้งานที่ต้องการความแม่นยำสูง.
• Multiplex PCR – ประกอบด้วยไพรเมอร์ที่สมดุลเพื่อขยายหลายเป้าหมายร่วมในปฏิกิริยาเดียว.
• qPCR แบบเรียลไทม์ – รวมถึงผู้รายงานเรืองแสง เช่น โพรบหรือสีย้อม DNA สำหรับการวัดปริมาณ.
• RT-PCR – ประกอบด้วยเอนไซม์ Reverse Transcriptase สำหรับขยายเทมเพลต RNA.
• Hot start PCR – ใช้โพลีเมอเรสที่กระตุ้นด้วยความร้อนซึ่งถูกบล็อกด้วยสารยับยั้งเพื่อปรับปรุงความจำเพาะโดยการลดผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณปลอม.
• Fast cycling PCR – เปิดใช้งานโปรโตคอลเทอร์โมไซคลิงที่รวดเร็วเพื่อเพิ่มปริมาณงาน.

มาสเตอร์มิกซ์หลายรายการยังได้รับการปรับให้เหมาะสมล่วงหน้าสำหรับการใช้งานกับเครื่องมือ PCR บางชนิดหรือสารเคมีในการตรวจจับ เช่น โพรบ TaqMan. ดังนั้นให้จับคู่มิกซ์พิเศษกับโปรโตคอล PCR เฉพาะของคุณ, เป้าหมาย, และแพลตฟอร์มเพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด.

qPCR Master Mix สำหรับการทดลองแบบเรียลไทม์

สำหรับ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (คิวพีซีอาร์) การทดลอง, specialized qPCR master mixes contain fluorescently labeled probes or DNA binding dyes to enable the detection and quantification of PCR products as they accumulate in “real-time” during thermocycling.

ประเภทมิกซ์ต้นแบบ qPCR แบบเรียลไทม์ทั่วไปบางประเภทประกอบด้วย:

• ซีบีอาร์ Green – สีย้อมแบบอินเทอร์คาเลตติ้งที่เรืองแสงเมื่อจับกับดีเอ็นเอที่มีเกลียวคู่.
• TaqMan probe – หัววัดฟลูออโรฟอร์-ดับเชอร์ถูกแยกออกระหว่างการขยายสัญญาณ.
• Molecular beacon – โพรบกิ๊บติดผมเรืองแสงพร้อมตัวดับเพื่อลดพื้นหลัง.
• Hybridization probe – โพรบที่อยู่ติดกันที่ใช้ FRET สำหรับการสร้างสัญญาณ.

การใช้ส่วนผสมหลักที่กำหนดสูตรและปรับให้เหมาะสมสำหรับเคมีการตรวจจับ qPCR เฉพาะของคุณ ช่วยลดความยุ่งยากในการตั้งค่าปฏิกิริยาและให้ความน่าเชื่อถือ, ผลลัพธ์ที่ละเอียดอ่อน.

วิธีสร้าง PCR Master Mix?

ในขณะที่ผลิตภัณฑ์ผสมหลักเชิงพาณิชย์คุณภาพสูงมีจำหน่ายอย่างแพร่หลาย, คุณยังสามารถสร้างมิกซ์หลัก PCR แบบกำหนดเองได้ ต่อไปนี้เป็นขั้นตอนสำคัญที่เกี่ยวข้อง:

1. เลือกเอนไซม์ DNA polymerase

นี่เป็นองค์ประกอบที่สำคัญที่สุดที่กระตุ้นการขยาย DNA. ตัวเลือกยอดนิยม ได้แก่ Taq, ฟู่, คำถามที่ 5, แรงผลักดัน, รหัส, ทีธ. พิจารณากระบวนการ, ความแม่นยำ, อัตราการขยาย, และความเข้ากันได้กับบัฟเฟอร์ PCR เมื่อเลือกเอนไซม์.

2. เตรียมบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา PCR ที่ปรับให้เหมาะสม

บัฟเฟอร์ให้ค่า pH ที่เหมาะสม, ความเข้มข้นของเกลือ, และความเข้ากันได้ของปัจจัยร่วมสำหรับกิจกรรมโพลีเมอเรส. ส่วนประกอบทั่วไปได้แก่:

• ทริส-HCl ค่า pH 8.5 – Maintains neutral pH at extension temperatures
• เคซีแอลหรือ (NH4)2SO4 – Monovalent cations for conductivity
• MgCl2 – Essential divalent cation cofactor for polymerase
• PCR enhancers – Betaine, ดีเอ็มเอสโอ, สารเพิ่มความคงตัวเช่น BSA

3. เพิ่มดีออกซีนิวคลีโอไทด์ที่สมดุล (dNTP)

ใช้การผสมผสานที่เท่ากันของ dATP, ดีซีทีพี, ดีจีทีพี, ดีทีพี. ความเข้มข้นมาตรฐานคือ 100-200 μM แต่ละตัว ดีเอ็นทีพี.

4. รวมปัจจัยร่วมที่จำเป็น

แมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) เป็นปัจจัยร่วมที่สำคัญสำหรับกิจกรรมและความจำเพาะของโพลีเมอเรส. รวมไว้ที่ 1-5 ความเข้มข้นสุดท้าย mM.

5. เพิ่มความคงตัว

ผงซักฟอกที่ไม่มีไอออนิก, ดีทีที, ทรีฮาโลส, ฯลฯ. ช่วยรักษากิจกรรมของโพลีเมอเรสระหว่างการเก็บรักษา.

6. ปรับความเข้มข้นของส่วนประกอบ

เพื่อความสะดวก, ทำส่วนผสมหลัก 2X หรือ 4X แบบเข้มข้นโดยการเพิ่มจำนวนส่วนประกอบเป็นสองเท่าหรือสี่เท่า.

7. ผสมส่วนประกอบให้ละเอียดก่อนแบ่งส่วน

หมุนวนอย่างแรงหรือปิเปตซ้ำๆ เพื่อให้แน่ใจว่าส่วนผสมหลักเป็นเนื้อเดียวกัน.

8. สร้างส่วนลงตัวแบบใช้ครั้งเดียวสำหรับการจัดเก็บ

หลีกเลี่ยงวงจรการแช่แข็งและละลาย. เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด, เก็บแช่แข็งและละลายส่วนลงตัวบนน้ำแข็งก่อนใช้งาน.

เมื่อพัฒนาส่วนผสมหลักของคุณเป็นครั้งแรก, ปฏิบัติตามสูตรบัฟเฟอร์และความเข้มข้นของส่วนประกอบที่แนะนำโดยผู้ผลิตโพลีเมอเรสเป็นจุดเริ่มต้น.

ปรับความเข้มข้นให้เหมาะสมผ่านการทดสอบซ้ำเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพสูงสุด, ความจำเพาะ, ความไว, และความสม่ำเสมอสำหรับโปรโตคอล PCR เฉพาะของคุณ, อุปกรณ์, และการประยุกต์ใช้.

วิธีใช้ PCR Master Mix

การใช้ส่วนผสมหลัก PCR ในปฏิกิริยาของคุณไม่ใช่เรื่องง่ายอีกต่อไป. ต่อไปนี้เป็นภาพรวมสั้นๆ ทีละขั้นตอน:

1. ละลาย – Let the refrigerated master mix thaw completely on ice.
2. กระแสน้ำวน – Mix well by vortexing or pipetting up and down to ensure homogeneity before aliquoting.
3. ส่วนลงตัว – Dispense appropriate volume of master mix per reaction into PCR tubes or plate wells based on the reaction size.
4. เพิ่มไพรเมอร์ – Pipette forward and reverse primers into each reaction tube/well.
5. Add template – เพิ่มตัวอย่าง DNA หรือเทมเพลตอื่นๆ ลงในแต่ละปฏิกิริยา.
6. เติม – If needed, เติมน้ำเกรด PCR พิเศษเพื่อให้ได้ปริมาตรปฏิกิริยาที่ต้องการขั้นสุดท้าย.
7. ผสม – Gently vortex or pipette mix to combine all components in each reaction.
8. Centrifuge – หมุนท่อ/แผ่นสั้นๆ เพื่อรวบรวมสิ่งที่อยู่ด้านล่าง.
9. พีซีอาร์ – Place reactions in a thermal cycler and start your PCR run!

เมื่อใช้มาสเตอร์มิกซ์, เพิ่มเทมเพลต DNA ไว้ท้ายสุดเสมอ, หลังไพรเมอร์, เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้ามระหว่างปฏิกิริยา.

PCR Master Mix ช่วยเพิ่มพลังในการขยาย DNA ได้อย่างไร?

ส่วนผสมหลัก PCR มีส่วนผสมที่จำเป็นสำหรับการขยาย DNA ในรูปแบบที่พร้อมใช้งาน. การใช้ส่วนผสมหลักช่วยลดความยุ่งยากในการตั้งค่าปฏิกิริยา, ลดข้อผิดพลาด, และเพิ่มความสม่ำเสมอ.

มีส่วนผสมหลักที่ได้รับการปรับปรุงประสิทธิภาพประเภทต่างๆ สำหรับ PCR มาตรฐาน, คิวพีซีอาร์, PCR ความเที่ยงตรงสูง, RT-PCR, และอื่น ๆ. คุณยังสามารถสร้างมิกซ์ที่คุณกำหนดเองได้, แต่ผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์มีการทดสอบคุณภาพและความสะดวกสบายอย่างกว้างขวาง.

การทำความเข้าใจ PCR มาสเตอร์มิกซ์ช่วยให้มั่นใจได้ถึงผลลัพธ์ที่ประสบความสำเร็จสำหรับความต้องการด้านการขยายสัญญาณทั้งหมดของคุณ. ด้วยพลังของการผสมผสานหลักในชุดเครื่องมืออณูชีววิทยาของคุณ, การทดลอง DNA กลายเป็นเรื่องง่าย.