實驗設計
該實驗涉及研磨和純化植物材料以獲得粗 DNA 萃取物. 然後使用該萃取物來鑑定沉澱物中存在的 DNA.
粗提煉
粗DNA的溶解度隨著NaCl濃度的增加先減少後增大, 濃度達到最小值 0.14 摩爾/公升.
將乙醇溶液添加到粗 DNA 萃取物中會導致 DNA 沉澱. 在 NaCl 濃度為 0.14 研磨液中mol/L, DNA的溶解度極小, 研磨時不利於DNA溶解，但有利於DNA沉澱. 另一方面, 在氯化鈉濃度為 2 研磨液中mol/L, DNA溶解度較高, 幫助 DNA 溶解, 但沉澱效果不如低 NaCl 濃度研磨液. 所以, 研磨液中不同NaCl濃度對粗DNA萃取的影響有待進一步分析.
純化
去除雜質的方法包括離心, 75℃水浴, 和冷 (4℃) 定居. 離心粗 DNA 萃取物，在離心管底部分離細胞碎片和蛋白質沉澱, 而大部分 DNA 仍保留在上清液中. 利用DNA和蛋白質耐熱性的差異, 將 DNA 萃取物維持在 75°C 10 水浴幾分鐘會導致蛋白質變性和沈澱. 4°C 冷沉澱進一步沉澱蛋白質, 多醣, 和其他物質, 實現雜質去除.
鑑別
在酸性溶液中加熱 DNA 會導致分子中 2-脫氧核糖殘基的降解, 導致2-脫氧核糖和ω-羥基-γ-酮戊醛的形成. 後者與二苯胺反應生成藍色化合物. 此反應無需事先將 DNA 溶解在 NaCl 溶液中即可發生.
本實驗涉及DNA的粗提, 和糖, 蛋白質, DNA樣本中的衍生物還可以與二苯胺形成各種有色物質. 所以, 二苯胺法不是精確的鑑別方法. 核酸和蛋白質在波長為 的紫外線範圍內具有峰值吸收 260 奈米和 280 奈米, 分別. DNA濃度可透過吸光度間接計算 260 奈米: DNA濃度 (微克/毫升) = A260 × 100 × 50. 另外, 計算A260與A280的比率可以評估DNA純度. 純 DNA 的 A260/A280 比率為 1.8, 在存在蛋白質污染的情況下，比率顯著降低.
透過比較沉積物質量, DNA濃度, 和純度, 以及兩組試管之間二苯胺鑑別的顏色變化, 可以分析 DNA 萃取的不同實驗處理的有效性.
材料和方法
實驗準備
裝置: 培養皿, 燒杯, 量筒, 玻璃棒, 粗棉布, 研缽和研杵, 試管, 試管架, 漏斗, 電子天平, 分析天平, 離心管, 離心機, 水浴, NanoDrop Lite 超顯微核酸/蛋白質分析儀, 新鮮花椰菜.
試劑: 95% -20°C 冷凍乙醇, 二苯胺試劑.
研磨液: 溶解 1.01 g Tris (羥甲基) 氨基甲烷在 5 毫升蒸餾水, 調節pH值至 8.0 使用 2 mol/L鹽酸, 然後加 0.876 (或者 11.69) 克氯化鈉, 3.72 g 乙二胺四乙酸 (乙二胺四乙酸), 和 2 G 十二烷基硫酸鈉 (安全資料表). 當以上化學物質全部溶解後, 將音量補足為 100 mL 加蒸餾水.
方法步驟
① 研磨和過濾: 用 NaCl 濃度的研磨溶液研磨花椰菜 0.14 摩爾/公升和 2 摩爾/公升, 然後過濾收集上清液.
② 除雜: 用三種不同的方法處理上清液以去除雜質, 即離心, 75℃水浴 + 4°C 沉降, 或僅 4°C 穩定. 離心參數為 3,000 轉速, 2 分分鐘, 在室溫下. “75℃水浴 + 4°C 沉降” 將裝有上清液的試管放入 75°C 水浴中 10 分分鐘, 然後在 4°C 冰箱中繼續沉降 10 分分鐘. “僅 4°C 穩定” 是指將上清液置於 4°C 冰箱中 10 分分鐘.
③ 沉澱: 將等體積的冷乙醇倒入試管中, 並讓它解決. 一旦出現白色絮狀物質, 用鑷子去除沉澱物, 空氣乾燥, 並稱重.
④ 鑑別: 使用 NanoDrop Lite 超顯微核酸/蛋白質分析儀測定 DNA 濃度並分析樣本的 DNA 純度. 使用二苯胺試劑進行定性鑑定. 樣品在二苯胺鑑定前不溶解或溶解在濃度為 2 不同體積的mol/L.
建議
研磨液 NaCl 濃度的優化
實驗結果表明, 無論是DNA濃度還是純度, 研磨液 NaCl 濃度為 2 摩爾/公升相比 0.14 摩爾/公升. 這表示當 NaCl 濃度為 2 摩爾/公升, DNA的溶解度較高. 儘管 NaCl 濃度為 0.14 mol/L更有利於後期DNA沉澱 (相比 2 摩爾/公升), 由於乙醇的作用，這種效果較弱. 另外, 較高的氯化鈉濃度會造成鹽效應, 促進蛋白質沉澱, 這有利於 DNA純化. 所以, 建議選擇研磨液 NaCl 濃度 2 摩爾/公升.
雜質去除方法的最佳化
實驗結果表明，不同的除雜方法各有優缺點, 去除蛋白質時會發生一些 DNA 損失. 從DNA純度分析, 離心是最佳選擇; 從 DNA 濃度, 4°C 穩定是最佳的; 考慮成本和操作難度, 4°C 穩定是最佳的. 所以, 三種除雜方法對實驗結果的影響相似, 但 4°C 穩定具有成本效益, 操作方便, 當時間和成本有限時實用.
沉澱處理的最佳化
實驗結果表明，當 “不溶解沉澱物。” 這可能是因為二苯胺與水接觸時會形成乳狀溶液, 阻礙灰藍色的觀察. 也, 溶液稀釋可能會導致顏色變淺, 使得很難觀察到不同的現象. 另外, 二苯胺可以互相吸附, 形成白色小顆粒, 阻礙顯色反應. 然而, 建議將沉澱物直接加入二苯胺試劑中鑑定或將沉澱溶解於少量 2 mol/L 氯化鈉溶液鑑別 (建議體積為二苯胺體積的四分之一). 此方法避免了沉澱物溶解導致的鑑定靈敏度下降.
