禽多瘤病毒核酸檢測試劑盒丨分子法

該產品需要冰袋包裝並透過 FedEx 或 UPS 運輸.

產品介紹：

該試劑盒可對禽多瘤病毒保守基因進行擴增檢測 (APV) 在樣本中，例如 鳥 羽毛, 血, 組織, 口腔/生殖器拭子, ETC. 透過引入內生內部參考, 核酸萃取、擴增過程可監控，確保檢測結果的準確性.

產品內容：

儲存條件：

-20℃保存, 保存期限至少為 12 月

實驗操作：

1. 樣品製備 (樣品製備區)

1.1 樣品要求：

• 羽毛: 收集至少 5 胸部的羽毛, 腹部, 或腿 (包括羽軸部分), 並且不要使用自然脫落的羽毛.
• 血: 使用 EDTA 作為抗凝血劑, 不要使用肝素作為抗凝血劑. 應使用新鮮全血, 或可在2~8℃保存長達 7 天, 或在-20℃保存長達 3 月. 盡量避免反覆凍融.
• 組織: 取新鮮肌肉或器官組織 (避免使用帶皮膚的樣品, 肌腱, 或難以加工的筋膜) 不超過100mg. 使用200-500μL無菌水製備組織勻漿, 然後進行後續的樣品製備.

1.2 樣品製備：

• 參考三獅生物說明書 “動物基因組DNA快速萃取試劑盒 (為了 聚合酶鍊式反應 分析)” (零件號: DP202), 或其他符合相關要求的核酸萃取試劑盒/方法, 用於萃取處理過的樣品.
• 將萃取的樣本核酸放入冰箱，盡量盡快進行檢測.
• 它可以在 4°C 下保存長達 7 天或在-20°C 下長達 6 月.

2 . 反應體系的製備 (加入樣品的反應區).

2.1 取出n+2個含有APV陽性對照的反應管, APV 陰性對照, 以及實驗所需的反應液 (n表示待測樣本數, 加 1 陽性對照, 和 1 陰性對照). 將試劑在室溫下完全解凍, 離心機用於 10 秒, 並將管壁和蓋子內的液體旋轉至管底. 將它們放入冰箱中以備後用.

2.2 然後, 添加2μL陰性對照, 萃取樣本核酸, 依序對反應液進行APV陽性對照. 關閉管蓋, 做出適當的記錄, 並保證每次反應總體積為25μL. 徹底混合內容物, 離心機用於 10 秒, 然後在PCR儀上進行擴增實驗.

3. PCR擴增 (擴增及產物分析區).

• PCR擴增過程如下:
  • 95℃預變性 3 分分鐘.
  • 95℃變性 10 秒.
  • 60℃退火延伸 40 秒, 總共為 35 週期.
  • 60℃收集螢光訊號.
• 在螢光檢測中, 為第一個頻道選擇 FAM (針對 APV 特定基因), 並為第二個頻道選擇 VIC/HEX (用於內源參考基因).
• 如果使用ABI系列即時螢光定量PCR儀, 如有需要，可提前聯繫廠商或自行添加ROX校準染料; 否則, 遵循正常程序.

4. 結果判定

4.1

• 如果 FAM 通道和 VIC/HEX 通道中陽性對照的 Ct 值為 <30 並顯示一個 “S”-成形擴增曲線, 陰性對照無Ct值或Ct值≥35且無 “S”-成形擴增曲線, 實驗結果有效.
• 否則, 應該重複實驗, 如果重複實驗仍然無效, 請聯絡技術人員.

4.2

• VIC/HEX 通道中樣品的 Ct 值應≤32，並顯示 “S”-成形擴增曲線, 顯示樣本萃取和擴增有效.
• 如果沒有 Ct 值或有 Ct 值 32 < CT≤ 35 在VIC/HEX頻道, 顯示樣本核酸萃取不達標或存在強烈抑制干擾 (例如酒精或消毒劑的殘留物, 抗凝血劑, ETC。) 抑制放大.
• 建議對樣本進行後處理，進行核酸萃取和擴增.

4.3 VIC/HEX通道偵測有效後, FAM頻道中的判定流程如下:

• CT值≤ 32 和 “S”-觀察到形狀的擴增曲線, 確定 APV 呈陽性, 顯示樣本中存在 APV 病毒.
• CT 值為 32 < CT < 35, 它被認為是可疑的, 並且樣品應重新測試 (透過重新萃取和檢測核酸, 建議先排除 “假陽性” 環境氣溶膠污染造成的結果). 如果排除氣溶膠污染後在 FAM 通道中重新測試顯示 Ct 值 < 35 和清晰的擴增曲線, 確定 APV 呈陽性; 否則, 被判定為負數.
• 無Ct值或Ct值≥ 35 和不 “S”-成形擴增曲線, APV 被確定為陰性, 顯示樣本中未檢出APV病毒.

預防措施：

1. 為防止污染, 實驗應嚴格分區操作. 分區之間最好有實體隔離，避免人為因素造成交叉污染. 實驗過程中穿實驗服和乳膠手套, 並在不同區域使用單獨的工具. 根據需要更換手套和實驗室外套. PCR 後, 不要立即打開蓋子. 在打開採樣之前等待充分冷卻，以盡量減少氣溶膠污染.
2. 使用前將試劑完全解凍, 但避免反覆凍融. 嚴格按照試劑說明進行配製, 樣品添加, 以及其他步驟. 工作台, 離心機, 移液器, 等器具應定期使用含氯消毒劑消毒, 乙醇, 核酸污染去除劑, 或紫外線燈.
3. 陰性結果不一定代表男性. 未知突變, 樣品品質差, 低濃度, 或核酸萃取中存在強抑制物質 (測試) 也可以導致 “消極的” 結果. 本試劑盒僅用於鸚鵡CHD-W基因的特異性擴增. 對於其他產品, 請諮詢廠家.
4. 本產品僅供一次性使用. 請勿反覆冷凍、解凍. 僅供科學研究之用，不得用於臨床診斷或其他用途.