產品概述
NR (歐共體 1.7.1.3) 是植物中廣泛存在的酶. 它在硝態氮轉化為氨氮的過程中起著至關重要的作用，也是一種誘導酶, 影響作物產量和品質. NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽: 三氧化氮- + NADH+H+→NO2- + 輔酶A+ + 水. 酸性條件下, 產生的NO2- 可以參與重氮化反應形成洋紅色化合物. 此化合物的吸收峰位於 540 奈米, 以及吸光度的變化 540 nm可以用來表示酵素的活性.
套件組件
- 誘導劑原液: 50 毫升× 1 瓶子
- 萃取液: 30 毫升× 1 瓶子
- 試劑一: 12 毫升× 1 瓶子
- 試劑二: 粉x 2 小瓶
- 試劑三: 15 毫升× 1 瓶子
- 試劑四: 15 毫升× 1 瓶子
- 標準: 1 毫升× 1 小瓶
溶液製備
- 誘導液: 使用前用蒸餾水將誘導劑儲備液稀釋10倍. 拿 10 mL 誘導儲備液並添加 90 毫升蒸餾水. 充分混合. 每次使用前新鮮準備.
- 試劑二: 添加 1 毫升蒸餾水. 等分並儲存於-20°C. 它可以存儲為 2 -20°C 下幾週. 使用前, 用蒸餾水將試劑二稀釋50倍. 拿 10 µL 試劑二並添加 490 µL 蒸餾水. 攪拌均勻.
- 標準: 準備一個 0.1 μmol/mL亞硝酸鈉標準溶液稀釋 10 μmol/mL亞硝酸鈉標準溶液在使用前用蒸餾水稀釋100倍.
筆記
- 如果吸光度大於 0.8, 用萃取液稀釋樣品. 注意計算公式中相應調整稀釋倍數.
- 嚴格依照樣品測定表中所列試劑添加順序進行實驗.
實驗步驟
我. 樣品處理
組織預處理:
- 將適量的誘導劑溶液加入燒杯中. 清洗新鮮樣品, 用濾紙將其吸乾, 並將它們放入誘導溶液中 (足以淹沒). 在黑暗中孵育 2 小時. 移除樣本, 用濾紙將其吸乾, 並在-20°C冷凍 30 分分鐘. 解凍樣品並再次用濾紙乾燥. (根據需要進行誘導治療. 一般來說, 不需要誘導治療. 如果預實驗結果顯示沒有活性, 誘導治療是必要的。)
- 大約稱重 0.1 g 樣品並加入 1 根據組織重量比例萃取液mL (G) 至萃取液體積 (毫升) 的 1:5 到 10. 在冰浴中研磨, 離心機在 8000 G, 4°C 為 10 分分鐘, 並收集上清液. 將上清液置於冰上以供測試.
細胞或細菌預處理:
- 將細胞或細菌樣本收集在離心管中並丟棄上清液. 添加 1 每毫升萃取液 5 百萬個細胞或細菌. 超音波處理細菌或細胞 (力量 200 瓦, 超音波處理 3 秒, 間隔 10 秒, 重複 30 次). 離心機在 8000 G, 4°C 為 10 分分鐘, 收集上清液並置於冰上以供測試.
二. 檢測步驟
- 將可見分光光度計預熱至少 30 分分鐘, 調整波長至 540 奈米, 並用蒸餾水調零.
- 樣品檢測:
| 試劑名稱 | 試管 | 控制管 | 標準管 | 毛坯管 |
|---|---|---|---|---|
| 樣本 | 100 微升 | – | – | – |
| 0.1 µmol/mL 標準溶液 | – | – | 100 微升 | – |
| 蒸餾水 | – | 375 微升 | – | 475 微升 |
| 試劑一 | 375 微升 | – | 375 微升 | – |
| 試劑二 | 125 微升 | 125 微升 | 125 微升 | 125 微升 |
| 試劑三 | 250 微升 | 250 微升 | 250 |
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