Solarbio ATP ADP AMP 含量 HPLC 測定試劑盒 50T | 48S

筆記: 測試前取兩個或三個不同的樣本進行預測. 操作設備: 高效液相層析 目錄編號: BC5114

尺寸：50T/48S

成分:

萃取液Ⅰ: 80 毫升×1. 2-8℃保存.

萃取液二：40 毫升×1. 2-8℃保存.

試劑一: 15 毫升×1. 2-8℃保存. 使用前, 拿 3.5 mL 試劑 I 並加入至 1000 超純水毫升, 調整其pH值至 6.15 與試劑II形成流動相B, 並密封它.

試劑二:10 毫升×1. 2-8℃保存.

ATP標準： 粉末×1. -20℃保存. 使用前, 1.8 加入mL蒸餾水配製 1 微摩爾 / mL ATP 標準溶液, 被凍結在 -20 ℃. 確保 ATP 的完整性, 避免反覆凍融.

ADP標準： 粉末×1. -20℃保存. 使用前, 2.34 加入mL蒸餾水配製 1 微摩爾 / mL ATP 標準溶液, 被凍結在 -20 ℃. 確保 ATP 的完整性, 避免反覆凍融.

安普標準： 粉末×1. -20℃保存. 使用前, 2.0 加入mL蒸餾水配製 1 微摩爾 / mL ATP 標準溶液, 被凍結在 -20 ℃. 確保 ATP 的完整性, 避免反覆凍融.

產品描述：

核苷酸具有重要的生物學功能. 它們是一類由三種物質組成的化合物: 嘌呤鹼基或嘧啶鹼基, 核糖或脫氧核糖, 和磷酸. 它們主要參與核苷的形成.

三磷酸腺苷 (ATP) 被認為是一種通用能源，對於所有生物體的生存和繁殖中的細胞合成至關重要. ATP 可透過多種細胞途徑產生. 最典型的例子是粒線體中三磷酸腺苷合成酶透過氧化磷酸化合成, 或透過植物葉綠體中的光合作用合成. ATP合成的主要能源是葡萄糖和脂肪酸.

二磷酸腺苷 (腺苷二磷酸) 廣泛存在於動物體內, 植物, 微生物, 和培養細胞. 在生物體中, ADP是高能量磷酸鍵斷裂的產物 (ATP) 水解失去磷酸根) 並釋放能量.

單磷酸腺苷 (AMP) 廣泛存在於動物體內, 植物, 微生物, 和培養細胞. 它是ATP和ADP在體內釋放能量後形成的. 它能繼續結合磷酸基形成二磷酸腺苷 (腺苷二磷酸) 和三磷酸腺苷 (ATP). 它是ATP不完全水解的產物.

ATP 、 腺苷二磷酸 、 AMP 的吸收峰位於 254 奈米, 其含量可用高效液相層析法測定.

需要但未提供的試劑和設備：

高效液相層析儀 (C18柱 (4.6×250毫米), 紫外線檢測器 (血管性WD)), 桌上型離心機, 可調式移液器, 砂漿/均化器, 棕色EP管, 50 注射器過濾器 (水, 0.45

微米), 注射器, 吸濾器, 過濾膜 (有機的, 水), 50 棕色注射瓶 (2 毫升), 乙腈 (色譜純, 500 毫升), 超純水.

實驗前的準備工作:

1. 使用 500 mL 色譜純乙腈 (流動相A) 和 1000 mL配置的流動相B用濾膜過濾，除去溶劑中的雜質，防止阻塞層析管柱. (乙腈用途 0.45 用於抽濾的 µm 有機濾膜, 配置的流動相 B 使用 0.22 用於抽濾的 µm 水過濾膜).
2. 將製備好的流動相 A 和 B 進行超音波檢查 30 分鐘排除溶劑中的氣體，防止堵塞色譜柱，影響實驗
3. 的準備 ATP標準品: 1 μmol/mL ATP 標準溶液以蒸餾水稀釋至 0.5 微摩爾/毫升, 0.1 微摩爾/毫升, 0.05 微摩爾/毫升, 0.01 微摩爾/毫升, 0.005 µmol/mL ATP 標準溶液. (配製的標準濃度僅供參考，可依實際樣品濃度調整). 使用含水注射器過濾器將標準品過濾到棕色注射瓶中進行測試 (測試前請置於室溫下, 以免影響保留時間).
4. 的準備 ADP標準: 1 μmol/mL ADP 標準溶液以蒸餾水稀釋至 0.5 微摩爾/毫升, 0.1 微摩爾/毫升, 0.05 微摩爾/毫升, 0.01 微摩爾/毫升, 0.005 μmol/mL ADP標準溶液. (配製的標準濃度僅供參考，可依實際樣品濃度調整). 使用含水注射器過濾器將標準品過濾到棕色注射瓶中進行測試 (測試前請置於室溫下, 以免影響保留時間).
5. 的準備 安普標準: 1 μmol/mL AMP 標準溶液以蒸餾水稀釋至

0.5 微摩爾/毫升, 0.1 微摩爾/毫升, 0.05 微摩爾/毫升, 0.01 微摩爾/毫升, 0.005 μmol/mL AMP 標準溶液. (配製的標準濃度僅供參考，可依實際樣品濃度調整). 使用含水注射器過濾器將標準品過濾到棕色注射瓶中進行測試 (測試前請置於室溫下, 以免影響保留時間).

程式

1. 樣品製備:

• • 組織樣本: 根據組織比例 (G): 提取液I (毫升) = 1:5〜10 (建議稱重 3 g 組織樣本並加入 1.5 mL 萃取液 I) 添加萃取液I, 冰上勻漿, 並在冰浴中提取 40 分分鐘. 離心機在 10000 轉速為 10 4°C 分鐘, 取上清液750μL, 加入750μL萃取物II, 搖勻 (5 分分鐘) 並攪拌均勻, 再次離心 10000 4°C 下的轉速 10 分分鐘, 取上清液用水性注射器過濾器過濾至棕色注射瓶中，室溫下待測 (之內 2 H).
  • 細胞樣本: 根據比例 10 百萬個細胞 (單位): 提取液I (毫升)= 1000~500:1 (建議採取 10 萬個細胞樣本並添加 1 mL 萃取液 I) 添加萃取液I, 超音波破碎冰上細胞 (功率300W, 超音波用於 3 秒, 的間隔 7 秒, 的總時間 3 分分鐘); 4℃離心, 10000 轉速為 10 分分鐘, 取上清液750μL, 加入750μL萃取物II, 搖勻 (5 分分鐘) 並攪拌均勻, 再次離心 10000 4°C 下的轉速 10 分分鐘, 取上清液用水性注射器過濾器過濾至棕色注射瓶中，室溫下待測 (2小時內).
  • 血清: 建議採取 0.4 毫升血清樣本, 添加 0.6 mL 萃取液 1, 並提取為 40 分鐘在冰浴中. 離心機在 10000 轉速為 10 4°C 分鐘, 取上清液750μL, 加入750μL萃取物II, 搖勻 (5 分分鐘) 並攪拌均勻, 再次離心 10000 4°C 下的轉速 10 分分鐘, 取上清液用水性注射器過濾器過濾至棕色注射瓶中，室溫下待測 (2小時內).

2. 決心 程式：

1. 開啟電腦, 打開HPLC各模組的開關按鈕, 安裝色譜柱, 開啟軟體, 並將方法組中的進樣量設定為10μL, 柱溫: 27℃, 流量 0.8 毫升/分鐘, 和波長 254 奈米, 洗脫程序如下表所示, 採樣時間為 70 分分鐘. 設定後, 保存方法群組.
2. 用流動相清洗色譜柱, 以乙腈的流動相比例平衡層析管柱: 流動相B (酸鹼度= 6.15) = 2: 98, 基線穩定後開始注射.
3. 檢測配製好的標準溶液, 注射量為 10 微升, ATP, 腺苷二磷酸, 和 AMP 可以在以下範圍內分開 10 分分鐘, 和 ATP 的保留時間, 腺苷二磷酸, AMP 大約是 7.8 分分鐘, 6.7分鐘和5.4分鐘 (系統的pH值, 柱子, 流動相, ETC. 是不同的, 保留時間不同, 僅供參考).
4. 檢測配製好的樣品溶液, 注射量為 10 微升, 並檢測ATP的峰面積, 腺苷二磷酸, 和 AMP 在相應的保留

3. 計算：

1. 繪製ATP標準曲線, 腺苷二磷酸, AMP標準濃度 (微摩爾/毫升) 為 x，峰面積為 y. 將樣品的峰面積代入標準曲線即可計算 ATP, 腺苷二磷酸, AMP濃度x1, x2, x3 (微摩爾/毫升) 在裡面

ATP含量 計算

1. 樣品重量

ATP (微摩爾/克)＝2×1×VE÷W=3×1÷W

ATP (μg/g）=2 x1 ×VE×551.14 ÷W=1653.42 x1÷W

VE: 萃取液I的體積, 1.5毫升; 瓦: 樣品重量, G; MATP: 551.14; 2: 樣品稀釋係數.

1. 液體體積:

ATP (微摩爾/毫升)＝2×1×VE÷VS=5×x1

ATP (μg/mL）=2 x1 ×VE×551.14 ÷VS =2755.7 ×x1

VE: 萃取液I的體積, 1毫升; MATP: 551.14; VS： 樣品體積, 0.4毫升； 2: 樣品稀釋係數.

1. 細胞數量

ATP (μmol/104個細胞)＝2×1×VE÷N=2×x1÷N

ATP (μg/g104細胞）=2 x1 ×VE×551.14 ÷N =1102.28×x1÷N

VE: 萃取液I的體積, 1毫升; MATP: 551.14; 氮: 細胞數, 104 作為一個單位; 2: 樣品稀釋係數.

ADP內容 計算

1. 樣品重量

腺苷二磷酸 (微摩爾/克)＝2×2×VE÷W=3×2÷W

腺苷二磷酸 (μg/g）=2 x2 ×VE×427.2 ÷W=1281.6 x2÷W

VE: 萃取液I的體積, 1.5毫升; 瓦: 樣品重量, G; MADP: 427.2; 2: 樣品稀釋係數.

1. 液體體積:

腺苷二磷酸 (微摩爾/毫升)＝2×2×VE÷VS=5×2

腺苷二磷酸 (μg/mL）=2 x2 ×VE×427.2÷VS =2136×x2

VE: 萃取液I的體積, 1毫升; MADP: 427.2; VS： 樣品體積, 0.4毫升； 2: 樣品稀釋係數.

1. 細胞數量

腺苷二磷酸 (μmol/104個細胞)＝2×2×VE÷N =0.002×2÷N

腺苷二磷酸 (μg/g104細胞）=2 x2 ×VE×427.2 ÷N =854.4×x2÷N

VE: 萃取液I的體積, 1毫升; MADP: 427.2; 氮: 細胞數, 104 作為一個單位; 2: 樣品稀釋係數.

AMP含量 計算

1. 樣品重量

AMP (微摩爾/克)＝2×3×VE÷W=3×3÷W

AMP (μg/g）=2×3×VE×499.19÷W=1497.57×3÷W

VE: 萃取液I的體積, 1.5毫升; 瓦: 樣品重量, G; 曼普: 499.19; 2: 樣品稀釋係數.

1. 液體體積:

AMP (微摩爾/毫升)＝2×3×VE÷VS=5×x3

AMP (μg/mL）=2×3×VE×499.19÷VS=2495.95×x3

VE: 萃取液I的體積, 1毫升; 曼普: 499.19; VS： 樣品體積, 0.4毫升； 2: 樣品稀釋係數.

1. 細胞數量

AMP (μmol/104個細胞)＝2×3×VE÷N =2×x3÷N

AMP (μg/g104細胞）=2 x3 ×VE×499.19 ÷N =998.38×x3÷N

VE: 萃取液I的體積, 1毫升; 曼普: 499.19; 氮: 細胞數, 104 作為一個單位; 2: 樣品稀釋係數.

筆記:

預防措施:

1. 檢測後, 色譜管需用高濃度超純水沖洗 (關於 20-30 柱體積) 防止色譜管堵塞. 最後, 依色譜管規格沖洗色譜柱，防止損壞色譜
2. 標準品的稀釋倍數應根據樣本中核苷酸的濃度來決定. 樣品中核苷酸的峰面積必須在不同濃度標準溶液的峰面積內. 標準品的稀釋倍數僅供參考. 如果樣本中的核苷酸濃度過高, 建議先稀釋
3. 萃取後的樣品在室溫下不穩定, 所以需要盡快操作.
4. 如果樣本數太大, 建議每天測試一次標準溶液 (一種標準溶液就足夠了) 以確定相應的保留