目錄號: BC3830

尺寸: 50T/48S

貯存： 試劑在室溫下運輸, 抵達後依要求保存, 並穩定在 0.5 年.

產品構成

試劑Ⅰ: 20 毫升×1. -20℃保存；

試劑Ⅱ: 60 毫升×1. -20℃保存.

試劑Ⅲ: 0.55 毫升×1. -20℃保存, 避光. 5mM pNA 標準品: 1 毫升×1. -20℃保存, 避光.

標準稀釋液的製備: 拿 9 mL 試劑 Ⅰ 並添加 1 試劑Ⅱ毫升數, 攪拌均勻, 並等待使用. (也可依試劑Ⅰ的配比配製: 試劑Ⅱ = 9:1).

產品描述:

Caspase 是參與細胞凋亡過程的蛋白酶家族, 包括超過 10 會員. Caspase-3是細胞凋亡過程中最重要的末端蛋白酶, 它也是研究最多的 caspase; 它活化 pro-caspase-2,6,7,9, 特異性水解多種關鍵的凋亡蛋白, 例如PARP, 並介導染色質凝聚, 凋亡小體形成, 和核 DNA 片段化.

caspase-3 比色測定基於勝肽底物 DEVD-pNA 的水解 (天門冬胺酸- 谷氨酸-纈氨酸-天門冬胺酸-對硝基苯胺) 透過 caspase-3, 導致對硝基苯胺的釋放 (核糖核酸) 部分. p- 硝基苯胺具有高吸光度 405 奈米. 透過檢測pNA可以計算Caspase的活性. 此試劑盒適用於哺乳動物組織和細胞.

需要但未提供的試劑和設備:

分光光度計/酶標儀, 100µL 比色皿/96 孔板, 離心機, 水浴/培養箱, 可調式移液器, 研缽/均質器, 冰, 和蒸餾水.

程式:

A. 樣品製備:

1. 細胞: 將細胞收集到離心管中, 離心並棄去上清液; 加入100μL試劑Ⅱ至細胞數 (關於 106 細胞), 搖勻後重懸沉澱, 然後站在冰上15分鐘, 4℃離心15000g 10 15 分分鐘, 取上清液並置於冰上 (它可以增加到 150-200 µL 試劑Ⅱ（若裂解不充分）)
2. 組織: 根據組織品質的比例 (G): 試劑Ⅱ體積 (毫升) 的 1:5-10 (建議權衡一下 0.1 g 組織並加入 1 試劑Ⅱ毫升數), 在冰浴中研磨或徹底切割, 將其放在冰上 15 分分鐘, 4℃離心 10-15 分分鐘, 取上清液置於冰上進行測試.

乙. 決心 程式:

1. 預熱分光光度計/酵素標儀 30 分分鐘, 調整波長至 405 奈米, 並將蒸餾水調至零.
2. 使用前, 5 mmol/L PNA 標準溶液稀釋至 200, 100, 50, 25, 5, 和 0 μmol/L標準溶液與標準溶液稀釋劑.
3. 樣品測定 (將下列試劑依序加入 96 孔板 / EP管)

C. 活動 計算:

1. 標準曲線的建立

根據標準管濃度製作標準方程 (X, 微摩爾/公升) 和ΔAS (y, 減去管子 0 專注). 將ΔAT的測定值代入標準方程式即可得到x (微摩爾/公升).

2. 根據酶活性增加的百分比

caspase-3 活性百分比增加 = ((實驗治療組AT)- AB) / ((實驗控制組AT)- AB) × 100%

此方法簡單可靠，可粗略測定酵素活力.

3. 依酵素活性計算

一個單位是裂解酶的量 1.0 37℃、飽和底物濃度下每小時 nmol 比色 pNA 底物. 我們可以計算樣品中的 caspase 活性.

Caspase-3 活性 (U/毫克蛋白質) = x × VR ÷ (心肺復甦×心肺復甦 ) ÷ T × 103 = 2x ÷ Cpr ÷ t

虛擬實境: 反應體系總體積, 0.1 毫升= 10-4 L; VS: 加入樣品體積, 0.05 毫升; 時間: 反應時間, 1 H; 心肺復甦: 樣品蛋白濃度, 毫克/毫升; 103: 單位換算係數, 1 微摩爾= 103 納摩爾.

筆記:

1. 由於試劑 I 含有還原劑 (數位地面電視), 建議稀釋樣品 2 用蒸餾水沖洗 1 次，然後用 Bradford 法測定蛋白濃度，減少 DTT 對蛋白濃度測定的干擾. 不建議使用BCA法測定蛋白質
2. Caspase活性值低最常見的原因是細胞尚未發生凋亡, 細胞量太少或觀察時間太短誘導凋亡時, 並不是劑量越大, 時間越長, Caspase 活性越高. 建議設定不同的劑量和時間點，例如 0, 2, 4, 8, 16, 和 24 小時檢測最佳觀察點.
3. 當被測樣品的值高於標準曲線上限時, 樣品可用試劑Ⅱ稀釋後重新測定.
4. 蓋緊96孔板並用封口膜密封. 孵化於 37 ℃, 顏色變黃時OD405值約為 0.2, 此時可以測量. 微小的顏色變化可以延長反應時間或過夜, 但當酵素活性較強時, 孵育時間太長會導致反應失去線性

最近的產品引用：

• 王斌 , 王坤 , 金濤 , 等人. NCK1-AS1增強神經膠質瘤細胞增殖, 放射抗性, 以及經由 miR-22-3p/IGF1R ceRNA 途徑產生的化療抗藥性[J]. 生物醫學 & 藥物治療, 2020, 129:110395.
• 王正 , 徐建華 , 牟建軍 , 等人. 在溫和寒冷環境中聚集的布氏田鼠心肌粒線體的超微結構新發現[J]. 比較生物化學和生理學 – A部分分子 & 綜合生理學, 2020, 249:110766.

參考:

• 柯恩總經理. 胱天蛋白酶: 細胞凋亡的劊子手. 生物化學雜誌, 1997, 326:1-16.
• 賈尼克R U, 斯普倫加特 M L, 瓦蒂·MR, caspase-3 在細胞凋亡中的新作用[J]. 細胞死亡和分化, 1999, 6:99-104.

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